髓源性抑制细胞在急性白血病中的表达及临床意义

朱凤凤，王会平，许旋旋，王芝涛，王极宇，陶千山，翟志敏

急性B淋巴细胞白血病(acute B lymphocytic leukemia, B-ALL)是来源于前体B细胞的恶性肿瘤，在儿童中发病率最高[1]。尽管大多数患儿可通过化疗治愈，但复发患者仍有很高的死亡风险，且成人的临床治疗效果更差[2]。髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是由骨髓祖细胞和未成熟骨髓细胞组成的异质细胞群。在健康个体中，骨髓中产生的未成熟骨髓细胞快速分化为成熟粒细胞、巨噬细胞或树突细胞。相反，在例如癌症、传染病及一些自身性免疫疾病中，未成熟骨髓细胞向成熟骨髓细胞分化的部分被阻断，导致未成熟骨髓细胞的扩增。这些具有免疫抑制活性的未成熟骨髓细胞群统称为MDSCs[3]。在人类中，MDSCs最常被定义为表达共同骨髓标志物CD33和CD11b、但缺乏HLA-DR表达的细胞[4]。由于它们的异质性，MDSCs可以进一步分为2个亚型：单核细胞来源的MDSCs(M-MDSCs)和粒细胞来源的MDSCs(G-MDSCs)[5]。M-MDSCs以非特异性方式抑制T细胞反应，主要通过上调精氨酸酶-1和一氧化氮合酶的表达[6]；G-MDSCs通过增强活性氧的产生来抑制T细胞的应答[7-8]。针对血液系统恶性肿瘤中的MDSCs已经显示出减缓疾病进展的作用[9]。然而，MDSCs在B-ALL发病机制中的作用仍然不是很清楚。课题组推测MDSCs作为一种免疫抑制细胞，可能在该病的进程中发挥重要作用。故该文旨在研究B-ALL患者外周血中MDSCs的表达及与疾病发展的关系，探讨该细胞在B-ALL患者疾病进展中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 病例资料收集2017年12月～2018年9月期间于安徽医科大学第二附属医院治疗的B-ALL患者85例(缓解组34例，未缓解组51例), 健康对照者15例,性别及年龄差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。B-ALL相关诊断参照2008年世界卫生组织(WHO)诊断标准进行细胞形态学、免疫表型、细胞遗传学和分子生物学确诊和分型。经标准化诱导方案化疗后，复查骨髓及外周血，评估临床疗效，疗效评估参照NCCN临床实践指南：急性淋巴细胞白血病(2017.V5)。排除标准：合并其他实体肿瘤、血液系统疾病及自身免疫性疾病；合并各种严重感染；妊娠或哺乳期妇女；合并其他严重的全身性疾病。

表1 各组的一般临床特征

1.2 方法

1.2.1外周血中MDSCs水平的测定 入组患者清晨空腹抽取静脉血，依次向流式管中加入荧光标记抗体CD10-FITC、CD14-PE、HLA-DR-ECD、CD33-APC、CD45-PC7，再加入静脉血50 μl，处理完成后用CytoFLEX流式细胞仪进行检测，分析CD14+HLA-DR-及CD10-HLA-DR-细胞分别占外周血单个核细胞的百分率，并作为M-MDSCs和G-MDSCs的细胞比例。

1.2.2B-ALL患者骨髓及外周血中微小残留病变(minimal residual disease, MRD)水平的测定 抽取患者静脉血或骨髓，依次向流式管中加入荧光标记抗体CD34-FITC、CD10-PE、CD19-APC、CD45-PC7，同时加入抗凝血或骨髓50 μl，处理完成后用流式细胞仪进行检测，记录CD10+CD19+细胞占单个核细胞的百分比。

1.2.3临床相关指标检测 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、白细胞介素-6(interleukin6, IL-6)等检测指标均在安徽医科大学第二附属医院临床检验医学中心进行。

2 结果

2.1 B-ALL患者外周血MDSCs水平与健康对照组比较对B-ALL患者进行临床疗效评估后，分为缓解组及未缓解组，分析显示未缓解组M-MDSCs高于健康对照组及缓解组(P<0.05)；缓解组M-MDSCs与健康对照组相比呈上升趋势。未缓解组及缓解组G-MDSCs均高于健康对照组(P<0.01)；未缓解组G-MDSCs高于缓解组(P<0.05)。见图1。

2.2 B-ALL患者不同危险度之间MDSCs的比较将85例B-ALL患者根据危险度分级分为中危、高危及极高危3组。分析3组患者外周血MDSCs可得：高危组M-MDSCs高于中危组(P<0.05)，极高危组M-MDSCs与高危组相比呈下降趋势，但差异无统计意义。在G-MDSCs中，随着危险度的升高，G-MDSCs水平也呈升高趋势，各组间均无统计学意义。见图2。

图1 健康对照组及B-ALL患者外周血中MDSCs占CD45+细胞的比例

与未缓解组比较：*P<0.05，**P<0.01；与健康对照组比较：##P<0.01；与缓解组比较：▲P<0.05

图2 B-ALL患者不同危险度之间MDSCs的比较

2.3 B-ALL患者有无中枢侵犯之间MDSCs的比较比较B-ALL有中枢侵犯及无中枢侵犯患者之间MDSCs的表达可得：有中枢侵犯的B-ALL患者较无中枢侵犯的B-ALL患者G-MDSCs升高(P<0.05)，M-MDSCs水平则呈下降趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 B-ALL患者有无中枢侵犯之间MDSCs的比较

2.4 B-ALL患者不同预后之间MDSCs的比较参照NCCN临床实践指南：急性淋巴细胞白血病(2017.V5)，评估B-ALL患者预后情况，比较预后良好、中间组及预后不良3者MDSCs水平显示，预后不良与预后良好组相比M-MDSCs水平升高(P<0.05)，随着预后变差，M-MDSCs呈一个上升趋势；在G-MDSCs中，预后不良组及中间组高于预后良好组(P<0.05)。见图4。

2.5 B-ALL患者外周血中MDSCs水平与骨髓及外周血MRD之间的相关性分析对B-ALL患者外周血M-MDSCs水平与骨髓及外周血MRD进行相关性分析，可以得出骨髓MRD水平与外周血M-MDSCs及G-MDSCs均呈正相关(P<0.024,P<0.05)。而外周血MRD与B-ALL患者M-MDSCs及G-MDSCs，差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.6 B-ALL患者外周血MDSCs与临床指标之间的相关性分析通过对B-ALL患者外周血MDSCs水平与患者的LDH水平进行相关性分析可以得出，M-MDSCs与LDH无相关性(P>0.05)，G-MDSCs水平与LDH呈正相关(P<0.05)；M-MDSCs和G-MDSCs与IL-6均呈正相关(P<0.05,P<0.05)。

图4 不同预后B-ALL患者外周血中MDSCs的表达水平

3 讨论

MDSCs最早在小鼠的Lewis肺癌模型中被发现[10]，因此在肿瘤疾病中的研究成为重点。Ornstein et al[11]研究发现肿瘤患者外周血MDSCs的表达水平显著高于健康人群，外周血 MDSCs 的表达水平与肿瘤分期成正相关，存在远处转移的Ⅳ期肿瘤患者外周血 MDSCs 的表达水平显著增加。MDSCs的扩增和活化由肿瘤微环境分泌的可溶性因子驱动。这些因素包括IL-6、粒细胞刺激因子和血管内皮生长因子等[12]。扩增的MDSCs通过抑制效应免疫细胞和(或)诱导调节性免疫细胞或免疫抑制细胞因子的产生，对抗肿瘤免疫力发挥强大的抑制作用[13]。因此，MDSCs的消耗可以增强当前临床治疗的效果，包括化疗和免疫治疗。在慢性粒细胞白血病患者中，较高水平的MDSCs可能会干扰免疫治疗的效果，慢性粒细胞白血病患者M-MDSCs水平显著增加，并且MDSCs的数量与患者的肿瘤进展和预后相关[14]。在多发性骨髓瘤患者的骨髓和外周血中，MDSCs的频率也明显增加，且MDSCs的频率与多发性骨髓瘤的疾病进展相关，并诱导患者的全身免疫抑制[15]。B-ALL来源于骨髓内的恶性前体B细胞。因此白血病细胞如何直接驱动骨髓中MDSCs的扩增，或扩增的MDSCs是否可直接影响白血病细胞的生长值得进一步研究。

本实验借助B-ALL患者，从外周血MDSCs的表达水平及其与疾病预后指标的相关性入手，探讨MDSCs在B-ALL的临床意义。通过比较其外周血中M-MDSCs及G-MDSCs的表达水平，显示未缓解组M-MDSCs高于健康对照组及缓解组；未缓解组及缓解组G-MDSCs均高于健康对照组，未缓解组G-MDSCs高于缓解组。借此推断B-ALL患者外周血G-MDSCs的表达水平可预测疾病的进展，缓解组MDSCs水平的减少可成为治疗效果的指标，并且MDSCs的表达可能与临床治疗反应相关，有效的临床治疗手段可杀伤肿瘤细胞，抑制MDSCs的扩增。因此针对明确诊断的B-ALL的患者，应及早行化学治疗或免疫治疗。分析B-ALL患者外周血MDSCs与疾病危险度及有无中枢侵犯之间的相关性表明：高危组M-MDSCs高于中危组；极高危组M-MDSCs与高危组相比呈下降趋势。而随着危险度的升高，G-MDSCs也呈上升趋势；中枢侵犯的B-ALL患者较无中枢侵犯的患者其G-MDSCs升高，M-MDSCs则呈下降趋势；比较预后良好、中间组及预后不良3者MDSCs水平显示，预后不良与预后良好组相比M-MDSCs水平升高，预后越差，M-MDSCs水平越高； G-MDSCs中，预后不良组及中间组均高于预后良好组，说明升高的MDSCs水平与B-ALL患者的疾病严重程度、有无中枢侵犯及预后可能呈正相关，外周血MDSCs水平对评估患者疾病危险程度及预防白血病中枢侵犯具有一定意义。另外课题组分析了B-ALL患者外周血中 MDSCs水平及其预后临床指标MRD及LDH、IL-6等指标的相关性。发现其骨髓MRD和外周血LDH、IL-6水平与B-ALL患者外周血M-MDSCs或G-MDSCs均呈正相关，表明就B-ALL患者而言，外周血MDSCs水平升高可能是导致B-ALL患者易复发、预后差的不良因素之一。