乙型病毒性肝炎患者血浆中miR-122及miR-155动态表达及意义

李 雪，王 悦，张 扬，蔡海峰，冯福民，张美航，吴冬雪，王 雪，张 咪，朱晗瑀，陈 琦，杨 帆

乙型病毒性肝炎(viral hepatitis type B)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)引起以肝脏急性或慢性炎性损伤为主的传染病。HBV感染是慢性肝炎、肝硬化、肝癌的危险因素[1]。因此，动态监控乙肝患者不同阶段肝指标的损伤情况，可以使患者更早的得到治疗。目前临床上多采用丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)作为肝损伤的检测指标，在肝损伤诊断、治疗效果评价中具有重要作用，但其特异性较差。miRNAs[1]作为非编码RNA的一种，越来越受到研究者的关注。李玉红 等[2]发现miR-122可通过调控其下游靶基因从而导致肝损伤的发生。Luna et al[3]发现在HBV感染患者中血清miR-122的表达增加，且与肝脏损伤程度密切相关。因此，研究人员推测miR-122可能参与了乙肝的发生发展。miR-155与乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染相关的肝细胞癌密切相关，研究[4]表明miR-155在调节炎症-肿瘤过程中具有重要作用。

现对乙肝患者血浆miR-122、miR-155进行实时监测，分析其与ALT、AST及相关因子的关系，为临床上早发现和治疗HBV导致的肝损伤提供新思路[3]。

1 材料与方法

1.1 病例资料2015年9月～2016年9月在唐山市第四医院住院的乙肝患者共86例作为研究对象，体检健康者共101例作为对照组，且民族均为汉族。研究对象均签订知情同意书。

纳入标准：对照组为ALT、AST正常的健康体检者，乙肝组均符合乙型病毒性肝炎诊断标准(WS299-2008)；年龄18～72(5.12±2.35)岁[1]。

排除标准：除HBV外的其他病毒感染者；孕产妇；合并其他肝病的患者；服用引起肝功异常药物者；有恶性肿瘤、血液病者；近1个月内有输血史者[1]。

1.2 问卷调查收集乙肝组及对照组的基础资料、抗病毒治疗方案、个人病史及用药史。

1.3 血液标本的收集与处理连续收集研究对象5次血样本，即入院后治疗前的第1份静脉血，治疗1、2、3、4周的静脉血；离心取上清液于EP管中，-80 ℃ 保存。

1.4 血浆中相关非编码RNA检测

1.4.1引物序列 在Pubmed上搜索出各基因的完整序列；引物的设计及合成均来自生工生物工程(上海)股份有限公司。见表1。

表1 扩增基因及引物序列

1.4.2qRT-PCR检测miR-122、miR-155的mRNA表达水平 TRIzol法提取血浆总RNA，测其浓度及纯度。反转录合成cDNA，RT-PCR检测mRNA表达水平。采用2-ΔΔCt计算结果。

1.5 ELISA法检测血浆中白细胞介素(interleukin,IL)-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、p53、CyclinD1等因子的含量试剂盒室温平衡20 min后取出板条，设置标准孔和样本孔，标准孔加不同浓度标准品各50 μl，样本孔加血清10 μl同时加入40 μl样本稀释液，各孔加入辣根过氧化物酶，封板膜封住，37 ℃温育后，洗板5次，每孔加入底物A、B，37 ℃温育后，加终止液，酶标仪选择波长450 nm处检测吸光度值(optical density,OD)值，最后通过标准曲线方程计算蛋白含量。ELISA温育过程不要贪快，要充分温育。试剂盒购自北京冬歌博业生物科技有限公司(批号：201611)。

1.6 统计学处理用SPSS 23.0对数据进行分析，一般因素采用χ2检验，计量资料采用进行统计描述，检测方差齐性，方差齐时，组间比较采用单因素方差进行分析，两两比较采用LSD检验，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义[4]。

2 结果

2.1 研究对象一般情况两组间在性别、年龄、文化程度、吸烟、饮酒等方面差异均无统计学意义(P>0.05)，两组具有可比性。见表2。

2.2 miR-RNA及其相关因子在对照组中的可信区间SPSS软件对健康对照者血浆中miR-122、miR-155、IL-6、TNF-α、p53及CyclinD1的表达水平进行统计描述，为实验组各指标的表达水平提供参考，见表3。

2.3 miR-RNA及其相关因子在乙肝患者血浆中的动态变化情况结果显示，miR-122、miR-155在乙型肝炎患者血浆中均存在异常表达。对乙肝组86例患者血浆进行5个时间点动态监测，检测时点为0(入院第1份血液标本)、1、2、3、4周，每组样本量分别为86、86、86、11、7例。结果表明miR-122表达在治疗第2周时表达量出现高峰，而在治疗第3、4周时表达水平逐渐降低；miR-155的表达则随着治疗周期的延长逐渐降低，并且与刚入院时相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 乙肝患者血浆各个时点miR-122、miR-155动态变化

表2 乙肝组和健康对照组一般情况分布[n(%)]

一般因素乙肝组(n=86)健康对照组(n=101)χ2值P值性别5.780.13 男63(73.2)65(64.4) 女23(26.8)36(35.6)年龄(岁)1.700.21 18～3012(13.0)20(19.8) >30～4533(35.6)48(47.5) >45～6037(40.0)32(31.7) >60～72 4(4.4) 1(1.0)文化程度0.170.94 小学及以下16(18.6)17(16.8) 初中31(36.0)39(38.6) 高中及以上39(45.4)45(44.6)吸烟0.040.89 吸烟49(57.0)59(58.4) 不吸烟37(43.0)42(41.6)饮酒1.900.18 饮酒57(66.2)57(56.4) 不饮酒29(33.8)44(43.6)

表3 miR-RNA及其相关因子在健康对照者血浆中的表达

IL-6、TNF-α、Cyclin D1表达随着治疗周期的延长逐渐下降，并且与刚入院相比差异均有统计学意义(P<0.05)。p53的表达水平随着治疗周期的延长则呈现上升趋势，与刚入院时相比差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2、3。

图2 乙肝患者血浆各个时点IL-6、TNF-α动态变化

2.4 miR-RNA与肝功指标及相关因子的相关性结果显示，miR-122、miR-155与ALT、AST、IL-6、TNF-α、CyclinD1等均呈正相关，miR-122与p53呈正相关，但miR-155与p53呈负相关；且miR-122、miR-155均与ALT的相关系数较大。见表4。

3 讨论

中国甲乙类法定报告传染病中，乙型肝炎的发病率和死亡率均位列前三，不容小觑。因此，对乙型肝炎病程及其肝损伤的程度进行有效监测，找到灵敏的监测指标对乙肝的发生发展具有重要意义。

图3 乙肝患者血浆各个时点p53、CyclinD1动态变化

表4 血浆miR-122、miR-155与ALT、AST及相关因子的相关性分析

指标统计值miR-122miR-155ALTr值0.490.60P值<0.01<0.01ASTr值0.470.56P值<0.01<0.01IL-6r值0.210.65P值<0.01<0.01TNF-αr值0.190.62P值<0.01<0.01p53r值0.16-0.28P值<0.01<0.01CyclinD1r值0.120.65P值<0.01<0.01

近年来，研究[5-6]表明miRNA在肝脏疾病的发生发展中发挥着重要作用。裴丽玲 等[7]发现肝细胞癌患者血清miR-451a的表达明显低于对照组，提示其与肝癌的迁移和恶性程度密切相关，在肝细胞癌诊断、治疗及预后方面具有较高的临床应用价值。孟凡龙 等[8]研究表明miR-106b在肝癌患者血清中表达量显著升高，可作为潜在生物标志。以上研究表明miR-RNA与肝病密切相关，该研究在乙型肝炎患者入院治疗前及治疗1、2、3、4周5个时点对血浆中miR-122、miR-155表达量进行检测，结果表明miR-122、miR-155的表达与刚入院时相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示miR-122、miR-155可能参与了乙型肝炎的发展过程。

有研究[9-11]显示miRNAs参与生命过程中的各种调节途径，包括细胞增殖和凋亡等。TNF-α作为重要的炎症介质，IL-6作为多功能细胞因子，其联合起来可作为反映机体炎症严重程度的重要指标。而ALT、AST等又是临床上反映肝脏损伤程度的重要指标，因此该研究通过分析miR-122、miR-155与ALT、AST及其相关因子的相关性，探讨miR-122、miR-155对乙肝患者的作用意义及可能的作用方式。结果显示，乙肝患者血浆中miR-122、miR-155的异常表达与乙型病毒性肝炎引起的肝损伤有关，并可能参与了乙肝的炎症反应和细胞周期调控。