人源重建皮肤模型的体外光毒性试验方法建立

康 桦，张劲松，桑 晶，匡 荣

(浙江省食品药品检验研究院，化妆品动物替代试验技术重点实验室，杭州 310004)

紫外光照射人体皮肤会产生辐射毒性[1]。光毒性评估是化学物质、药品和化妆品安全性评估的重要内容。近年来，动物试验检测光毒性的方法逐渐被体外评估系统替代。目前已被验证和认可的体外评估方法有经济合作与发展组织化学品测试指导原则中的《体外3T3细胞中性红摄取光毒性试验方法》(OECD 432)[2]，《化妆品安全技术规范》(2015年版)中的《化妆品用化学原料体外3T3中性红摄取光毒性试验》[3]。但是，目前采用的体外检测系统存在着较大缺陷。首先，这种单层培养的成纤维细胞系统相对于三维皮肤是一种简单的基础系统。其次，一些非水溶性的化学物质因为难溶于水只能用低浓度检测。此外，该系统不能检测许多复杂的混合物或者配方产品。重建皮肤模型光毒性试验是一个有意义的潜在替代方法。目前，已有研究者开发了利用人源重建皮肤模型EpiSkin的体外光毒性试验方法。先前研究认为该方法能够评估化学物终产品和复杂配方的光毒性[4]。中国广东博溪生物科技有限公司研发了人源重建皮肤模型EpiKutis，并已应用在皮肤刺激性和腐蚀性试验方面。我们针对国产人源重建皮肤模型在光毒性评估方面做进一步研究，以期建立中国人源重建皮肤模型EpiKutis体外光毒性试验方法。随后，我们选取一些已知的化学物对该方法进行验证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1皮肤模型 EpiKutis是由广东博溪生物科技有限公司提供，货号PM1011。EpiKutis是以中国人皮肤组织分离出的角质形成细胞为种子细胞，使用精细调节的无血清培养基促使细胞在体外发育成复层化结构的3D表皮模型。EpiKutis具有高度类似于人类皮肤的复层化结构、生理及代谢功能。

1.1.2主要试剂 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(Aladdin，批号：I1402131)；异丙醇(国药集团化学试剂有限公司，批号：20160108)；培养液(广东博溪生物科技有限公司，货号：PY3031A/B/C)；磷酸盐缓冲液(HBSS)(GIBCO，货号：14025-092，批号：1836493)；丙酮(TEDIA，批号：15110659)。

1.1.3受试物 盐酸氯丙嗪(CAS：69-09-0)(东京化成工业株式会社，批号：E7X5M-Es)；盐酸异丙嗪(CAS：58-33-3)(SIGMA，批号：SZBE023XV)；8-甲氧基补骨脂(CAS：298-81-7)(SIGMA，批号：MKBT6032V)；十二烷基硫酸钠(CAS：151-21-3)(SIGMA，批号：SLBJ7382V)。

1.1.4主要仪器 HERAcell 150i型号二氧化碳培养箱(Thermo Scientific公司)；SpectraMax 190型号紫外-可见光连续光谱酶标仪(Molecular Devices Corporation公司)；XS104型号电子天平(METTLER TOLEDO公司)；SOL 500 RF2型号光源(Honle UV technology公司)；UV-Meter μC型号光照度仪(Honle UV technology公司)。

1.2 方法

1.2.1预培养 将EpiKutis放入已加入0.9 mL培养液的六孔板中。在标准条件(37 ℃±1 ℃、5%±1% CO2、95%相对湿度)下预培养1 h，随后更换培养液，继续在标准条件下预培养24 h。

1.2.2受试物处理 次日将EpiKutis转移到新的六孔板中。在不同光照时间对皮肤模型相对活性的影响试验时，每个EpiKutis给予50 μL HBSS。在不同浓度盐酸氯丙嗪对皮肤模型光毒性作用试验时，给予浓度为1 000、200、100、20和4 mg·L-1的盐酸氯丙嗪溶液50 μL。在阳性对照盐酸氯丙嗪溶液浓度确定试验时，给予浓度为200、100 mg·L-1的盐酸氯丙嗪溶液50 μL。在已知的4个化学物对EpiKutis体外光毒性

Tab 1 Effect of UVA exposure time on cell viability of EpiKutis n=3)

*P<0.05,**P<0.01vs60 min

Tab 2 Phototoxic effect of different doses of chlorpromazine on EpiKutis after UVA n=3)

**P<0.01vsnon-UVA exposure (-UVA)

试验方法的验证试验时，给予盐酸氯丙嗪、盐酸异丙嗪、8-甲氧基补骨脂、十二烷基硫酸钠等4个化学物溶液50 μL，受试物溶液浓度见Tab 5。以上试验中阴性对照均给予50 μL HBSS。8-甲氧基补骨脂溶液溶剂为丙酮，阴性对照溶液为丙酮。给予受试物溶液后EpiKutis继续在标准条件下培养过夜。

1.2.3光照 d3给予EpiKutis光照强度为(1.7±0.1) mW·cm-2的长波紫外线(ultraviolet A, UVA)照射。在不同光照时间对皮肤模型相对活性的影响试验时，分别分组进行光照40、60、80、100 min处理，不光照处理的皮肤模型放置在同一室温的暗处；其余试验均光照60 min处理。光照处理完成后的EpiKutis转移到新的六孔板中，每孔加0.9 mL培养液，培养过夜(21 h)。

1.2.4活性检测 d 4进行MTT检测，将EpiKutis转移至已加入0.3 mL的1.0 g·L-1MTT溶液的24孔板中，标准条件培养3 h。取出EpiKutis放入新的24孔板中，每个孔加入2 mL异丙醇，室温震荡2 h溶解甲瓒。随后从上述每个EpiKutis中吸取200 μL含甲瓒的溶液分别加到96孔板中，采用异丙醇作为空白对照。测定570 nm波长处吸光度值。除不同光照时间对皮肤模型相对活性的影响试验时，相对活性为光照后吸光度值与此相对应的不光照的吸光度值的比值，其余试验的相对活性均为受试物吸光度值与阴性对照吸光度值的比值。

2 结果

2.1 不同光照时间对皮肤模型相对活性的影响光照80 min或100 min后明显降低EpiKutis细胞活性。40 min或60 min光照对EpiKutis细胞活性几乎无影响。因此，确定选用60 min为光照时间。见Tab 1。

2.2 不同浓度盐酸氯丙嗪对皮肤模型光毒性作用盐酸氯丙嗪在100、200 mg·L-1浓度时对EpiKutis有轻微的细胞毒性，在1 000 mg·L-1浓度时有严重的细胞毒性。盐酸氯丙嗪在20、100及200 mg·L-1浓度时对皮肤模型有光毒性作用，且随浓度增大光毒性作用增强。盐酸氯丙嗪在4 mg·L-1浓度时对皮肤模型既无细胞毒性也无光毒性作用。见Tab 2。

2.3 阳性对照盐酸氯丙嗪溶液浓度确定盐酸氯丙嗪溶液浓度为100、200 mg·L-1时光照后皮肤模型相对活性降低平均值均为30%以上。见Tab 3。

Tab 3 Phototoxic effect of 100, 200 mg·L-1 chlorpromazine on EpiKutis after UVA exposure

*P>0.05vs100 mg·L-1

浓度为100、200 mg·L-1的盐酸氯丙嗪溶液对皮肤模型有一定的细胞毒性，100 mg·L-1时细胞毒性较轻微。因此，我们确定阳性对照盐酸氯丙嗪溶液的浓度为100 mg·L-1。见Tab 4。

Tab 4 Effect of 100, 200 mg·L-1 chlorpromazine on cell viability of EpiKutis

*P<0.05vs100 mg·L-1

2.4 已知的4个化学物对EpiKutis体外光毒性作用结果见Tab 5。

3 讨论

目前，已经通过验证的用于评估化学物光毒性风险的方法是《体外3T3细胞中性红摄取光毒性试验方法》(OECD 432)[2]。然而，这个方法采用的是单层细胞体系，其最大的缺点是水难溶性化学物质和化妆品配方产品不能采用这个方法。具有复杂的三维结构的皮肤模型能模拟全身性给药途径的化学物质吸收方式。EpiKutis存在有机的结构(多层和分化的表皮)、屏障功能(角质层)、基本构成细胞的来源(角质形成细胞来源于人类皮肤)等这些特性，更能模拟人类体内的环境。因而，可以应用于对具有不同生物化学特性的大多数化学物质，如疏水性或固体化学物质、复杂的混合物或配方等产品的光毒性检测。

《化妆品安全技术规范》(2015年版)中《化妆品用化学原料体外3T3中性红摄取光毒性试验》：光源要求为UVA，透过96孔组织培养板盖的光强度建议为(1.7±0.1) mW· cm-2, 照射剂量为5 J·cm-2[3]。OECD的指导原则《体外3T3中性红光毒性试验》(OECD 432)中对光源的规定为：光源为UVA，光照强度为(1.7±0.1) mW·cm-2，照射剂量为5 J·cm-2，照射细胞时间为50 min[2]。从试验结果我们可以得到：40、60 min光照时间对皮肤模型活性几乎无影响。因此确定光照条件为：光源UVA、光照强度(1.7±0.1) mW·cm-2、光照时间60 min。

Tab 5 Phototoxic effect of four chemicals on EpiKutis after UVA exposure

*P<0.05 ,**P<0.01vsnon-UVA exposure (-UVA)

研究资料表明：UVA照射后，盐酸氯丙嗪会导致皮肤模型活性剂量依赖性显著降低，与不光照皮肤模型相比活性均下降超过25%[4-7]。皮肤模型Skin2的试验数据已经通过验证：皮肤模型光照处理后相对活性比不光照处理降低30%以上认为该受试物有光毒性作用[5,8]。其他皮肤模型也通过试验对结果评价标准相对活性比降低30%以上进行了验证[6,7]。本试验结果表明，在盐酸氯丙嗪溶液浓度为100、200 mg·L-1时，皮肤模型光照处理后相对活性比不光照处理均降低30%以上。盐酸氯丙嗪在100、200 mg·L-1浓度时对皮肤模型有一定的细胞毒性，浓度为100 mg·L-1时细胞毒性比较轻微。所以阳性对照盐酸氯丙嗪溶液的浓度确定为100 mg·L-1。因此，确定《人源重建皮肤模型(EpiKutis)体外光毒性试验方法》结果评价标准为：皮肤模型光照处理后相对活性比不光照处理降低30%以上认为该受试物有光毒性作用。

我们选取一些已知的化学物质进行方法验证：盐酸氯丙嗪、盐酸异丙嗪、8-甲氧基补骨脂为已知的光毒性化学物；十二烷基硫酸钠为已知的光毒性阴性化学物。4个化学物皮肤模型相对活性降低试验数据与历史参考数据比较大体一致[9]。盐酸氯丙嗪、盐酸异丙嗪、8-甲氧基补骨脂为有光毒性化学物；十二烷基硫酸钠为无光毒性化学物。试验结果表明上述4个化学物通过《人源重建皮肤模型(EpiKutis)体外光毒性试验方法》进行检测，能够正确评估其光毒性。因此，我们认为《人源重建皮肤模型(EpiKutis)体外光毒性试验方法》能够初步评估化学物的光毒性，可以推荐为皮肤光毒性替代检测方法。