鼠呼肠孤病毒3型荧光定量RT-PCR检测方法的建立

禹思宇，周智君，谭建锡，胡忆文，唐连飞※

（1.长沙海关技术中心，湖南长沙410004；2.中南大学实验动物学部，湖南长沙410008）

呼肠孤病毒3 型 (Reo3)为呼肠孤病毒科的正呼肠孤病毒属的代表株。病毒粒子具有特征的二十面体对称双层衣壳结构，成熟病毒无包膜,大小约75nm[1]。病毒基因组是分节段双股RNA(dsRNA)，全基因组分为 L (L1、L2、L3)、M (M1、M2、M3)、S(S1、S2、S3、S4)3 组共 10 个节段基因组成[2]，编码 8种结构蛋白，3 种非结构蛋白,共11 种蛋白[3]。呼肠孤病毒可以感染多种脊椎动物，包括马、牛、猪、绵羊、豚鼠、犬、猫、貂、禽类、蝙蝠以及人、黑猩猩和猴，除了感染啮齿动物和禽外，一般不引起明显的疾病，特别是对成年动物。鼠类能自然感染Reo3，其临床表现为黄疸、运动失调、油性被毛、生长发育迟缓等[4]。呼肠孤病毒在人类的某些呼吸道及消化道疾病的发生上，呈现一定的辅助或促进作用,能引起儿童腹泻、呼吸道感染及脑膜炎等疾病[5-6]。

呼肠孤病毒3 型是实验动物SPF 级大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠的必检项目，目前针对Reo3 的检测方法主要有酶联免疫吸附方法（ELISA）[7]，以及普通RT-PCR 方法[8]，这些方法在Reo3 的临床检测中发挥了一定的作用，但具有灵敏性不高、稳定性差等限制。建立确定Reo3 感染的快速精确检测方法在Reo3 诊断及流行病学调查中具有重要意义。荧光定量PCR 检测方法具有快速、高灵敏度和高特异性的优点，在兽医临床的快速检测中应用广泛。本研究拟建立一种Reo3 的快速检测方法，为今后Reo3 筛查和监控提供有效手段。

1 材料与方法

1.1 病毒株

呼肠孤病毒3 型(Reo3)、小鼠肺炎病毒由上海海关技术中心提供，鼠肺炎病毒（PVM）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、古典猪瘟病毒（CSFV）、牛病毒性腹泻粘膜病病毒（BVDV）核酸均为实验室保存。

1.2 仪器与试剂

核酸自动提取仪MagNA Pure LC 2.0、480II 荧光定量PCR 仪及核酸提取试剂盒MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit 购自 Roche 公司，T7体外转录试剂盒购自 Ambion 公司，One-Step RT-PCR 试剂盒购自ABI 公司。

1.3 引物和探针的设计及合成

根据NCBI 网站上的公布的呼肠孤病毒3 型(Reo3)全基因序列，将不同株M1 基因进行比对，利用DANStar 软件进行序列比对分析，选取Reo3的M1 基因保守区序列作为引物设计的靶标，并利用Primer Express 3.0.1 软件设计特异性引物探针:Reo3-F1: 5'-GTGCATCATTCCGTTTGGTAAA-3'，Reo3-R1:5'-TGCCAACATTA AATCGAGAGTGA-3';Reo3-P：FAM-AGGTGGGTCGTGTTC-BHQ1。引物和探针由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 标准品的制备

全自动核酸提取仪提取Reo3 的RNA 后，用反转录获得的病毒cDNA 为模板，以M1 基因为靶标进行PCR 扩增，引物上游加入T7 启动子序列。设计的引物序列分别为 Reo3-F2：ggatatgaggctggtgacgttat，Reo3-R2：ggatggactcaatatcaacccca。PCR 产物进行测序验证后，以PCR 产物为模板进行体外转录，反应体系分别包括10×Reaction Buffer、ATP solution、CTP solution、GTP solution、UTP solution、Enzyme Mix 各 2μL；PCR 产物 0.1～0.2μg；加水至总体积20μL。37℃2～4 小时后在体外转录体系中加入 2μL RNase-free DNase，37℃ 孵育 15min，除去DNA 模板。随后用饱和酚-氯仿抽提去除残留的DNase 和RNA 聚合酶。

1.5 标准曲线的建立

将标准品按照10 倍倍比稀释，由此得到1.0×101～1.0×1010copy/μL 的标准品，按照荧光RT-PCR 反应体系及条件进行扩增，以读取的Ct值为Y 轴，以标准品浓度的对数为X 轴，建立Reo3荧光PCR 方法的标准曲线。

1.6 荧光定量RT-PCR反应方法体系及反应条件

配制荧光定量RT-PCR 反应液，每管20μL：含 4×RT-PCR buffer 5μL，10 pmol/μL ，Reo3-F、Reo3-R 1μL，10 pmol/μL TaqMan 探 针 0.5μL，RNase Free dH2O 7μL，模板2μL。反应条件为第一阶段，45℃ 10min，95℃ 10min；第二阶段为 95℃15sec，60℃ 45sec（收集荧光），40 个循环。

1.7 敏感性、特异性和重复性

以 1.0×101～1.0×1010copy/μL 10 个 10 倍稀释的标准品为模板，根据上述已知反应条件进行荧光定量RT-PCR，评估该方法的敏感性；按照上述已知的反应条件，以PVM、PRRSV、CSFV、BVDV、AIV 为模板，进行荧光定量RT-PCR，同时以Reo3 ssRNA 作为阳性对照，细胞培养液作为阴性对照，评估该方法的特异性。

以 1.0×106～1.0×108copy/μL 3 个 10 倍稀释的标准品为模板，每个浓度重复三次实验，检测组间重复性。计算Ct 值变异系数，检测PCR 体系的稳定性。

2 结果

2.1 Reo3荧光PCR检测方法标准品鉴定

利用Reo3 M1 部分基因片段设计并合成的引物进行PCR 扩增，经过琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出片段大小523 bp 的特异性条带，大小与预期一致，见图1。

将片段回收纯化，其序列结果与可以检索到Reo3 的病毒株M1 片段一致，体外转录后抽提获得的ssRNA，经测定浓度为24 ng/μL，将之稀释为2.95 ng/μL，拷贝数为 1×1010copy/μL，分装备用。

2.2 标准曲线的建立

利用不同浓度的标准品建立Reo3 荧光RT-PCR 方法的标准曲线，结果显示当标准品在1.0×101～1.0×1010copy/μL 范围内，相关系数为R2=0.9990，表明标准品浓度的对数与Ct 值之间有很好的线性关系（如图2），以荧光Ct 值为Y 轴，浓度的对数值为X 轴，由此得到的线性方程为：y=-2.170x+41.52。

2.3 Reo3荧光定量RT-PCR检测方法的敏感性、特异性、重复性试验

以 1.0×101～1.0×1010copy/μL10 个 10 倍稀释的标准品为模板，根据已优化的反应条件进行荧光定量RT-PCR，结果显示该方法最低能检测到1.0×102copy/μL Reo3，具有较高的检测灵敏度。（图 3）

以 Reo3、PVM 、PRRSV、CSFV、BVDV、AIV 为模板，根据已优化的反应条件进行荧光定量RT-PCR，同时设置阴性对照，结果显示只有Reo 3具有特异性扩增曲线（如图4），其他病毒模板和阴性对照均无扩增曲线，表明该方法对Reo3 具有良好的特异性。

以 1.0×106～1.0×108copy/μL 3 个 10 倍稀释的标准品为模板，每个浓度重复三次实验进行组间重复性试验，结果显示，Ct 值组间变异系数（CV）在0.54%～1.04%之间，均小于2%，表明该方法具有较好的重复性（如表1）。

表1 Reo3 荧光PCR 重复性实验结果

3 讨论

呼肠孤病毒（Reovirus，Reo）是一种人畜共患的病毒，Reo3 是该病毒属的代表株。Reo3 可隐性感染动物并在体内产生抗体，从而给血液制品、单克隆抗体、细胞培养等外来致病因子的检定及动物试验带来一定的困难[9]。实验动物微生物学等级及监测（GB 14922.2-2011）将Reo3 列为SPF 等级实验动物必须排除的病原微生物[10]。目前针对Reo3 的检测方法主要有酶联免疫吸附方法（ELISA）[7]，以及普通RT-PCR 方法[8]，这些方法在Reo3 的临床检测中发挥了一定的作用，但具有灵敏性不高、稳定性差等限制。因此，建立一种方便、快速、灵敏的的检测方法对于Reo3 的诊断非常必要。

本实验所建立的Reo3 实时荧光RT-PCR 检测方法，特异性试验结果显示，该方法除对Reo3 有扩增反应外，对其它相关病毒均无扩增反应，引物具有良好的特异性；通过敏感性实验，可以看出标准品浓度在 1.0×102～1.0×1010copy/μL 之间时，其浓度的对数值与荧光定量RT-PCR 实验中的Ct 值之间有良好的线性相关性（相关系数R2=0.9990），且该标准品检出限为1.0×102个copy/μL。同时，该方法实验间的变异系数为0.54%～1.04%之间，均小于2%，表明该方法扩增稳定性高、重复性强。

本实验所建立的Reo3 荧光定量RT-PCR 检测方法特异、敏感、可靠，稳定性好，检测的准确性高，可为实验动物中Reo3 的监测以及流行病学研究提供特异、敏感、快速的方法。