干巴菌多糖提取工艺优化及抗氧化活性的研究

赵红艳，张鸭关，史俊友

(曲靖师范学院化学与环境科学学院，云南 曲靖 655011)

干巴菌(ThelephoraganbajunZang)主要分布于我国西南地区，在云南省主要分布在昆明、呈贡、嵩明、安宁、曲靖、马龙等地，其分布集中在海拔1 000～1 200 m的松林中[1-2]。该菌隶属于担子菌门、革菌目、革菌科、革菌属[3]。干巴菌外貌不突出，但营养丰富，含有粗蛋白、粗脂肪、总糖、灰分等营养元素，同时还含有16种氨基酸、多种微量元素、维生素及其特有的具有高营养保健价值的革菌酸[4-6]。干巴菌还有一定的药用价值，因其含有的多糖体是医药方面最强的调节剂和免疫剂，同时又因该多糖成分能够提高相应淋巴细胞活性，从而能够在癌症的增殖及转移方面发挥抑癌作用[7]。干巴菌还含有极丰富的抗氧化物质，能够清除人体内的各种加速细胞凋亡甚至让细胞坏死的氧化自由基，进而达到延缓衰老的作用[8]。作者以干巴菌多糖提取率为评价指标，采用单因素实验及正交实验优化干巴菌多糖的提取工艺，通过测定干巴菌多糖对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基及羟基自由基的清除率来评价其抗氧化活性，为干巴菌的进一步研究提供理论依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

野生干巴菌，采自云南省曲靖市，清洗干净后,于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，备用。

苯酚、无水乙醇、七水合硫酸亚铁、过氧化氢、铁氰化钾、葡萄糖、磷酸氢二钠、三氯乙酸、水杨酸、浓硫酸、三氯化铁、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、芦丁标准液等均为分析纯。

JK-G-350A3型植物粉碎机，上海精学科学仪器有限公司；TU-1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；KM-1000型电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器厂；AL204-IC型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.2 干巴菌多糖的提取

精确称取干巴菌粉末2.0 g于烧杯中，按照一定料液比加入蒸馏水，于一定温度下在恒温水浴中提取一定时间，过滤；将滤液浓缩至20 mL，加入乙醇使乙醇浓度达到80%，静置过夜；5 000 r·min-1离心10 min，过滤，干燥，得干巴菌多糖。采用苯酚硫酸法测定干巴菌多糖含量。

1.3 干巴菌多糖提取工艺优化

1.3.1 单因素实验

采用单因素实验，分别考察料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，g∶mL，下同)、提取温度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)、提取时间(1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h)对干巴菌多糖提取率的影响。

1.3.2 正交实验

在单因素实验的基础上，以提取温度、提取时间及料液比为考察因素进行正交实验，因素与水平见表1。

1.4 干巴菌多糖的抗氧化活性评价

参照文献[9]方法测定干巴菌多糖对DPPH自由基的清除率，参照文献[10]方法测定干巴菌多糖对羟基自由基的清除率。

表1正交实验的因素与水平

Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiments

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对干巴菌多糖提取率的影响(图1)

图1 料液比对干巴菌多糖提取率的影响

从图1可以看出，随着料液比的减小，即提取溶剂用量的增加，干巴菌多糖提取率呈先升高后降低的趋势；当料液比为1∶15时，干巴菌多糖提取率最高。因此，确定最佳料液比为1∶15。

2.1.2 提取温度对干巴菌多糖提取率的影响(图2)

图2 提取温度对干巴菌多糖提取率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides from Thelephora ganbajun Zang

从图2可以看出，随着提取温度的升高，干巴菌多糖提取率呈先升高后降低的趋势；当提取温度为60 ℃时，干巴菌多糖提取率最高；继续升高提取温度，多糖提取率反而下降。因此，确定最佳提取温度为60 ℃。

2.1.3 提取时间对干巴菌多糖提取率的影响(图3)

图3 提取时间对干巴菌多糖提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides from Thelephora ganbajun Zang

从图3可以看出，随着提取时间的延长，干巴菌多糖提取率呈先升高后降低的趋势；当提取时间为2.0 h时，干巴菌多糖提取率达到最高；继续延长提取时间，多糖提取率反而下降。因此，确定最佳提取时间为2.0 h。

2.2 正交实验结果(表2)

表2正交实验结果

Tab.2 Results of orthogonal experiments

由表2可知，各因素对干巴菌多糖提取率的影响不同，提取温度对多糖提取率的影响最大，其次是提取时间，料液比对多糖提取率的影响相对较小。综合考虑，确定最佳提取工艺条件为A3B3C2(实验9#)，即提取温度70 ℃、提取时间2.5 h、料液比1∶15，在此条件下，多糖提取率为10.08%。

2.3 干巴菌多糖的抗氧化活性

2.3.1 对DPPH自由基的清除率(图4)

图4 干巴菌多糖对DPPH自由基的清除率Fig.4 Scavenging rate of DPPH free radicals by polysaccharides from Thelephora ganbajun Zang

从图4可以看出，干巴菌多糖对DPPH自由基的清除率随多糖浓度增加而升高；当浓度为5 mg·mL-1时，干巴菌多糖对DPPH自由基的清除率达到86.99%，略低于VC。干巴菌多糖对DPPH自由基的半数清除率有效质量浓度(IC50)为1.91 mg·mL-1。

2.3.2 对羟基自由基的清除率(图5)

图5 干巴菌多糖对羟基自由基的清除率Fig.5 Scavenging rate of hydroxyl free radicals by polysaccharides from Thelephora ganbajun Zang

从图5可以看出，干巴菌多糖对羟基自由基的清除率随多糖浓度增加而升高；当浓度为5 mg·mL-1时，干巴菌多糖对羟基自由基的清除率达到87.46%，略低于VC。干巴菌多糖对羟基自由基的IC50为2.25 mg·mL-1。

2.4 讨论

多糖是由超过10个、几百甚至几千个单糖分子聚合而成的一类化合物，广泛分布于自然界中，是一类重要的活性物质。多糖由于其分子中含有大量极性基团，对水分子具有较大的亲和力[11]。一些分子量较小、分支程度较低的多糖在水中有一定溶解度，因此，水提取法是提取植物多糖最常用的方法。缪园欣等[12]从铁皮石斛花中提取多糖，在超声时间为55 min、料液比为1∶50、微波时间为 3 min的条件下，多糖提取率为7.22%。钟丽霞等[13]从山楂中提取多糖，在提取温度为63 ℃、微波功率为500 W、提取时间为7 min的条件下，多糖提取率为14.71%。本研究采用热水法提取干巴菌多糖，多糖提取率为10.08%，介于两者之间。

人体因为各种因素，体内不断地产生自由基，研究表明，癌症、衰老或其它疾病大都与过量自由基的产生有关。测定对自由基的清除能力是评价抗氧化活性的主要方法。王白娟等[14]研究了大红菇多糖的抗氧化活性，在大红菇多糖浓度为0.4 mg·mL-1时，对羟基自由基的清除率达68.74%、对DPPH自由基的清除率达61.80%，与同浓度的VC的清除率相当。本研究中干巴菌多糖浓度较低时，抗氧化活性比VC低，当多糖浓度达到5 mg·mL-1时，干巴菌多糖的抗氧化活性略低于VC。

3 结论

在单因素实验的基础上，采用正交实验优化了干巴菌多糖的提取工艺，并通过测定干巴菌多糖对DPPH自由基及羟基自由基的清除率来评价其抗氧化活性。确定干巴菌多糖的最佳提取工艺条件为：提取温度70 ℃、提取时间2.5 h、料液比1∶15(g∶mL)，在此条件下，多糖提取率达到10.08%。该方法对干巴菌多糖的提取具有一定的参考价值。干巴菌多糖对DPPH自由基及羟基自由基均具有较好的清除效果，当干巴菌多糖浓度为5 mg·mL-1时，其对DPPH自由基和羟基自由基的清除率分别达到86.99%、87.46%。