中性粒细胞胞外诱捕网在中性粒细胞表型哮喘治疗中的研究进展

姚文静 万滢 李玲义 薛庆亮

哮喘(Asthma)是一种气道慢性炎症性肺疾病，其特征是气道对过敏原的高反应性、可逆性气流受限、气道水肿和粘液分泌增加。哮喘根据诱导痰中浸润的粒细胞不同，可分为四种不同的表型[1]，分别为嗜酸性粒细胞，中性粒细胞，混合性粒细胞和少粒粒细胞表型。中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil Extracellular Traps, NETs)是Brinkmann等[2]在2004年首次报道，当机体受到炎症刺激时，中性粒细胞从血液中迁移到感染部位；它们通过吞噬、脱颗粒、NETs的形成释放来有效地捕获、杀灭病原微生物。尽管大多数嗜酸性粒细胞哮喘患者对糖皮质激素敏感[3]，但中性粒细胞表型哮喘对糖皮质激素疗效欠佳。中性粒细胞表型哮喘的患者气道中形成了NETs，NETs在中性粒细胞表型哮喘中可能促进了疾病的发生发展，对治疗产生一定的影响。本文就针对NETs在中性粒细胞表型哮喘治疗中的作用进行综述。

NETs的形成、形成过程及降解

一、NETs的形成及结构

NETs的形成被认为是宿主防御入侵病原微生物的机制之一；当生物体被感染产生炎症时，中性粒细胞被激活并释放形成NETs。细菌感染部位的NETs形成释放，被认为是中性粒细胞的非经典功能。多项研究表明，白介素-8(IL-8)[4]、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)[5]、脂多糖(LPS)[6]、佛波酯(PMA)、尿酸单钠(MSU)晶体、细胞因子等可诱导中性粒细胞的活化。随后，活化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(NOX2)产生大量的活性氧(ROS)，这些ROS通过与toll样受体4(TLR4受体)结合从而导致中性粒细胞核膜的裂变。此外，细胞内中性粒细胞弹力蛋白酶(NE)、髓过氧化物酶(MPO)通过中性粒细胞核膜的分裂迁移到细胞核，它们在细胞核内降解组蛋白并促进染色质的去浓缩[7]。并且，肽酰基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)诱导的组蛋白的瓜氨酸化进一步促进了染色质的去浓缩[8]。有研究报道钙结合可能参与了PAD4的活化，而ROS可能参与调节了PAD4的活化[9]。染色质去浓缩后，DNA释放与颗粒状细胞质和各种蛋白混合，然后主动地排出到细胞外空间，形成了NETs。NETs是由细胞外的DNA、组蛋白和颗粒蛋白组成[5]，其中DNA为NETs的主要结构，并且颗粒蛋白包括NE、MPO、组织蛋白酶G(CG)、乳铁蛋白、蛋白酶3(PR3)、溶菌酶和钙卫蛋白等。NETs结构的完整性为其功能提供了基础。

二、NETs的降解

Farrera 等[10]报道了单核细胞衍生的巨噬细胞能够有效清除中性粒细胞挤出的NETs。巨噬细胞对NETs的快速清除可以防止产生针对DNA或NETs其他成分的自身免疫反应。巨噬细胞对NETs的清除不足可能会导致自身免疫性疾病。Frese[11]提出DNA酶I(DNase I)存在于血液中，通过降解NETs的主要结构DNA从而预防狼疮性肾炎的发展。DNase I的酶活性取决于阳离子环境，在Mg2+和Ca2+存在的环境中，该酶可以切割DNA双螺旋中的单链。

NETs的生物学作用

一、NETs的抗微生物作用

NETs已被证明可捕获和杀死革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌，真菌，寄生虫和原生生物。中性粒细胞通过释放NETs来捕获限制那些因太大难以被吞噬的细菌如酵母菌和单个的细菌[12]。NETs捕获和杀死病原微生物可能与其组分相关，其中NE可以通过切割病原微生物的毒力因子并防止其从吞噬溶酶体中逸出来，以此来灭活和杀死病原微生物；组蛋白可以分解病原微生物细胞膜，并限制微生物的生长；MPO的活性对于消灭金黄色葡萄球菌至关重要[13]，它也可以催化形成具有杀菌作用的次氯酸盐；钙卫蛋白是胞质蛋白S100A家族的成员，它通过螯合二价金属离子锌来抑制真菌的生长，因为锌是真菌生长所需的阳离子[7]；微生物捕获过程的发生是通过基于带正电荷的细菌表面与带负电荷的染色质纤维之间的静电相互作用来完成的[14]。

二、NETs的免疫作用

NETs形成与自身免疫性疾病的相关性首先在ANCA相关的血管炎中证实，随后在其他自身免疫性疾病中描述，包括银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA)[15-16]。NETs中的颗粒蛋白可能是自身抗原的来源，其中包括ANCA相关血管炎中的MPO，SLE中的dsDNA抗体和RA中的抗环瓜氨酸肽抗体(ACPA)[17]。NETs的颗粒蛋白不仅充当免疫复合物形成和自身抗体的靶标，而且还进一步诱导NETs形成。NETs还可以通过产生I型干扰素和激活补体系统的经典途径和代替途径来促进自身免疫。在银屑病和SLE中，NETs的细胞外DNA能够诱导浆细胞样树突状细胞(pDC)产生干扰素-α(IFN-α)[18]。 pDC是IFN-α的主要生产者，通常是对入侵病毒做出反应的。具有dsDNA核含量的NETs同样可以通过pDC来诱导IFN-α的产生。然后，IFN-α可以激活先天和适应性免疫系统，特别是诱导Th 1型通路，抑制T细胞凋亡，激活B细胞和抗体产生[19]。

三、NETs的不良反应

①促进痰液粘稠：肺囊性纤维化(CF)患者的痰液含有丰富的NETs，这导致CF患者难以咳出粘稠的痰液。当给予CF患者DNase治疗时，CF患者痰液变得稀薄，较易咳出，可能与DNase可以降解NETs中的DNA结构有关[20]，从而达到治疗CF。②过度反应：尽管NETs具有抗微生物的特性，但在某些情况下，NETs的过量存在或无法被DNase降解时可能对宿主有害，因此，NETs被认为是“先天免疫的双刃剑” 。NETs的成分，例如细胞外DNA、组蛋白和NE具有促炎作用，并且会促进疾病发生与进展[21]。③促血栓作用：Fuchs等[22]首次报道了NETs的促血栓作用。该研究表明，NETs可以捕获血小板，促进其活化和聚集。NETs还被证明可以通过为红细胞和促凝血因子提供支架来促进凝血酶的形成，例如血管性血友病因子(VWF)、纤维蛋白原、XII因子(FXII)和组织因子(TF)。NETs的组蛋白-DNA主链被认为可以增加血栓中纤维蛋白支架的稳定性[23]。在组蛋白-DNA复合物存在的情况下，纤维蛋白原凝块会导致纤维蛋白的纤维变粗，增加纤维蛋白凝块的稳定性以及显着延长凝块的溶解时间[24]。

NETs在中性粒细胞表型哮喘治疗中的研究进展

一、NETs在中性粒细胞表型哮喘发生发展中的作用

①直接的炎症反应：有报告表明[25]，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞可以在哮喘患者气道中产生细胞外DNA诱捕网。并且在患有哮喘的患者支气管活检中检测到了NETs和嗜酸性粒细胞外诱捕网(EETs)的形成[26]。与非中性粒细胞人群相比[27]，中性粒细胞表型哮喘患者的诱导痰中NETs及其组分有所增加，即细胞外DNA、抗菌肽LL-37和CXC趋化因子配体8(CXCL8)/ IL-8明显升高。Marrah E通过实验证明[28]，哮喘患者痰液中的细胞外DNA与气道中性粒细胞炎症相关，这与肺功能和哮喘的有效控制呈负相关。一项新的研究表明[29]，NETs可以通过破坏气道上皮并引发炎症反应，从而加剧中性粒细胞表型哮喘的严重程度。已经发现中性粒细胞表型哮喘患者的LPS水平升高，表明NETs可能与LPS的存在有关；此外，IL-8可能是这些气道发生NETs的潜在诱因，因为先前在其他研究中已经证明它会诱发NETs形成[30]。在中性粒细胞表型哮喘患者的气道中，活化的中性粒细胞产生的NETs可能增强对感染的抵抗。中性粒细胞表型哮喘患者的肺部中性粒细胞浸润明显。研究表明[31]，中性粒细胞通过诱导粘液分泌过多和气道重塑在中性粒细胞表型哮喘恶化中起着至关重要的作用，这分别可导致急性可逆性和进行性不可逆性气道阻塞。②免疫损伤：NETs的增加会加重中性粒细胞表型哮喘患者的症状；在中性粒细胞表型哮喘患者中，肺泡巨噬细胞降解NETs的能力受到损害[10]，从而导致中性粒细胞表型哮喘持续存在。以上提示气道中的NETs促进了中性粒细胞表型哮喘发生发展。

二、重组人DNA酶(rhDNase)在哮喘治疗中的作用

中性粒细胞表型哮喘患者通常表现出严重的症状[32-33]，对传统的糖皮质激素治疗无反应。此外中性粒细胞表型哮喘患者服用糖皮质激素治疗后可加剧肺部炎症，因为糖皮质激素可以延长中性粒细胞的生存期[34]。da Cunha通过实验证明[35]，重组人DNase(rhDNase)可以降解哮喘小鼠模型的细胞外DNA诱捕网，并降低气道阻力及改善肺功能。他通过在第0 d和第7 d给予小鼠两次皮下注射卵清蛋白(OVA)致敏，然后在第14 d，第15 d和第16 d给予OVA鼻内攻击3次。对照组使用磷酸盐缓冲液(DPBS)代替OVA，从而建立哮喘小鼠模型，在第15 d和16 d时，给予OVA攻击2 h后小鼠接受1 mg/mL的鼻内rhDNase；从而得出，鼻涕中的细胞外DNA在哮喘小鼠模型的下气道阻塞中起到一定的作用，当给予rhDNase治疗，可减少细胞外DNA诱捕网的形成，并显著的降低下气道阻力。在个案报道[36]，针对急性严重性哮喘的患者，给予rhDNase和吸入糖皮质激素联合治疗，可以降低痰液的黏稠性，并改善肺通气。

总结与展望

NETs是一把“双刃剑”，既可以起到捕获病原体、杀菌等作用，也可启动免疫应答对机体造成损伤。NETs产生过多或降解减少，都可以引起免疫性疾病的发生和进展。然而，目前为止NETs形成及降解的机制尚不明确，在疾病中的发病机制有待进一步的研究。NETs在中性粒细胞表型哮喘可能促进了疾病发生与进展的作用。rhDNase的治疗为哮喘的患者带来了曙光。