人胚胎干细胞RNA的细胞质和细胞核内的定位

周凡琦，冯文新，谭普文，马艳妮，王 栋，余 佳*

(1.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005；2.河南地矿职业学院， 河南 郑州 450000；3.南方医科大学基础学院 生物信息系， 广东 广州 510000)

人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)是研究早期胚胎发育的细胞模型。人受精卵在受精后5 d内形成胚泡期胚胎，hESCs从胚泡期胚胎的内细胞群中分离出来[1-2]，hESCs具有无限的复制潜力和多能性，能够分化成人体内任何体细胞类型[1]。这一特性使其有机会更新非功能性损伤组织，如帕金森病、脊髓灰质炎等疾病，目前基于hESCs治疗多种疾病的研究在临床前阶段已经取得了十分不错的成绩[3-4]。

RNA定位在细胞发育、命运决定等方面具有重要作用，如酵母细胞在分裂时，ASH1 mRNA定位于子细胞芽尖，进行局部翻译以调控其交配型的选择，从而确保子细胞产生与母细胞不同的交配类型[5-6]。在果蝇胚胎中，Bicoid mRNA定位于胚胎前极，Oskar mRNA、Nanos mRNA定位在后极，这种定位模式有助于果蝇胚胎建立形态梯度，为发育中的胚胎形成合适的空间模式奠定基础[7-9]等。这些mRNA及其蛋白产物在特定的亚细胞位置中发挥独特的功能，对于细胞正常的生理活动具有极为重要的意义，同时越来越多的研究表明，mRNA特定亚细胞的定位现象十分普遍。对果蝇3 000多个转录本进行高分辨率免疫荧光分析，结果显示约有71%的mRNA在早期胚胎中表现出显著的亚细胞定位模式[10]。

目前RNA定位的研究主要集中研究果蝇胚胎或酵母细胞中RNA广谱定位，揭示低等生命及哺乳动物细胞中某些特定RNA的定位及机制。哺乳动物细胞中对广谱RNA定位及其机制的研究较少，暂无研究报道hESCs中RNA细胞核和细胞质定位图谱。本研究主要探讨hESCs细胞核和细胞质中RNA定位详情及其特点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：hESCs为H1细胞系(中国医学科学院血液学研究所赠送)。

1.1.2 主要试剂：matrigel(Corning公司)；DPBS(Gibco公司)；mTeSR1、ReLeSR和Accutase(STEMCELL公司)；核质分离试剂盒(Thermo Fisher Scientificals公司：NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents)；Trizol、M-MLV反转录试剂盒(Invitrogen公司)；SYBR GREEN mix(全式金生物科技有限公司)；抗HSP90抗体、抗Fibrillin抗体(Proteintech公司)；山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗(上海碧云天生物有限公司)；引物(天一辉远测序公司)；建库及测序(诺禾致源公司)。

1.2 方法

1.2.1 hESCs体外培养：将matrigel铺至6孔板4 ℃过夜后接种H1克隆，使用mTeSR1培养。观察密度，4～6 d传代1次：DPBS清洗细胞，加入1 mL ReLeSR室温静置1 min后吸净，将细胞放至37 ℃孵箱中6～8 min，加入3 mL mTeSR1将克隆重悬，传代至6孔板中进行培养。在培养过程中，DPBS、mTeSR1均需37 ℃预热并且每天换液。

核质的分离：使用Accutase将H1克隆消化成单细胞，吸取10% input后1 000 r/min离心得到细胞沉淀。使用核质分离试剂盒，按照细胞体积加入适量预冷CER1重悬细胞，涡旋振荡15 s，冰上孵育10 min；加入预冷CER2，涡旋振荡5 s，冰上孵育1 min；涡旋振荡5 s后21 000×g离心5 min，立即转移上清至干净的EP离心管中，此为细胞质成分(cytoplasmic extraction，CE)；向剩余沉淀部分中加入适量预冷NER，涡旋振荡15 s后冰上孵育40 min，且每10 min振荡混匀15 s；21 000×g离心10 min，转移上清至干净的EP离心管管中，此为细胞核成分(soluble nuclear extraction，SNE)，SNE成分中不包含染色质部分。

1.2.2 Western blot检测细胞核与细胞质标志蛋白的表达：提取input、CE、SNE蛋白后进行SDS-PAGE电泳，湿转法转到PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜：HSP90、Fibrillin。TBST洗涤后加入二抗室温孵育40 min，TBST洗膜后，用化学发光法显影。

1.2.3 RT-qPCR检测细胞核与细胞质标志基因的表达：使用Trizol法提取RNA，采用M-MLV及Random primer法进行反转录，得到cDNA。RT-qPCR反应体系为：SYBR GREEN mix 5 μL，上下游引物(10 μmol/L)0.2 μL，cDNA 0.5 μL，去离子水4.1 μL；反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；溶解曲线生成的反应程序为：95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。引物序列(表1)。

表1 RT-qPCR引物Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.2.4 建库测序及生物信息学分析：将1 μg input/CE/SNE 总RNA去除rRNA并纯化回收，而后进行链特异性建库及测序；每组样品均有两个重复组；建库及测序项目编号为P101SC18060916-01。

使用Trimmomatics(v0.36)对原始测序数据进行质量控制，利用Hisat2(v2.0.5)将原始数据比对至GENCODE(v28)参考基因组(mm10)后，利用featurecounts计算基因表达量并计算TPM值。进一步利用edgeR计算差异表达基因以及挖掘亚细胞组分特异基因，Metascape被用于功能富集分析(gene ontology，GO)，并使用pheatmap包绘制热图。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 hESCs核质的分离

分离hESCs细胞核与细胞质后检测其标志基因可见细胞质标志基因HSP90蛋白与β-actin RNA主要定位在细胞质中(P<0.001)；细胞核标志基因Fribillin蛋白与U6主要定位于细胞核中(P<0.001)(图1)。

2.2 hESCs中RNA核质定位图谱

hESCs核质中总RNA的测序结果显示，细胞质中共定位30 232个RNA(TPM>1)，这些RNA类型丰富，共57种RNA，其中34%为蛋白编码基因，17%为加工假基因，12%为基因间长链非编码RNA(long intergenic non-coding RNA，lincRNA)(图2A)。细胞核中共定位34 390个RNA(TPM>1)，共31种RNA，其中74%为蛋白编码基因，7%为lincRNA，6%为反义RNA(图2B)。

尽管很多RNA同时定位于胞质与核质，但也存在特异性定位于胞质或核质的RNA。hESCs细胞质中特异定位的RNA多于细胞核(图3C)，其中细胞质中特异性定位2 952个RNA，约91.8%为mRNA，5.22%为加工假基因(图3A)；细胞核中特异性定位RNA共634个，其中41.42%为mRNA，21.89%为lincRNA(图3B)。这些基因的GO结果显示(图3D)，细胞质中RNA功能丰富，参与细胞多种生理功能，如参与合成核糖核蛋白复合物、核苷酸代谢、氨基酸代谢、蛋白质折叠、细胞分裂等，在细胞的正常生理活动中起重要作用。细胞核中特异定位的RNA较少，其富集的GO条目也较少，包含钾离子反应、非钠离子依赖的有机阴离子运输、减数分裂重组等核内生理活动相关调控。可见hESCs细胞核和细胞质中特异性定位的RNA功能特点与其定位特点紧密相关。

2.3 RT-qPCR验证

根据上述分析结果各选择10个细胞核和细胞质特异定位的RNA进行验证，验证结果与测序结果一致(P<0.05)(图4)，表明测序及分析结果真实可信(图4A)。细胞质中不仅特异性定位mRNA，如EEF2、HMGA1、LIN28A；此外还有一些非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)同样定位于此，如EEF1A1P5、TUBBP1、RPS28P7等(图4B)。除ncRNA外，细胞核中也有mRNA的定位，如自然杀伤细胞激活性受体(natural killer cell triggering receptor，NKTR)。

A.Western blot assay for markers(HSP90 and Fibrillin); B.RT-qPCR detection of marker genes(β-actin and U6);*P<0.001 compared with CE

A.TOP5 of RNA types in CE; B.TOP5 of RNA types in SNE图2 hESCs细胞核和细胞质中RNA类型Fig 2 RNA types of cytoplasm and nucleus of hESCs

A.TOP5 of RNA types of specifically localized in cytoplasm; B.TOP5 of RNA types of specifically localized in nucleus; C.heatmap of specific transcripts between subcellular fractions; Colors indicate the percentile of the relative expression level; D.gene ontology(GO) enrichment analysis of specific transcripts between subcellular fractions; biological duplicates

图3 hESCs中RNA细胞核和细胞质定位图谱
Fig 3 The localization of RNA in cytoplasm and nucleus of hESCs(n=2)

3 讨论

研究者既往工作表明在胚胎发育过程中，RNA的精准定位及其定位的变化均具有重要调控作用。如在果蝇发育的胚胎期，orb mRNA逐渐在胚胎后极的细胞核周围形成独特的环状结构；同时，grp mRNA由弥散状态逐渐定位至胚胎后极以发挥其功能[8,11]。hESCs具有分化为人体内220多种细胞类型的潜力，它的分离与体外培养具有极其重要的基础研究和临床应用价值，明确hESCs的RNA定位图谱对于探索hESCs全能性的维持及研究RNA定位的生理功能具有重要意义。

A.RT-qPCR detection of the expression of cytoplasmic localized RNAs,**P<0.001 compared with SNE; B.RT-qPCR detection of the expression of soluble nuclear localized RNAs,*P<0.05,**P<0.001 compared with CE

目前研究表明， RNA定位并局部翻译的调控模式在细胞生命活动中具有极大优势，首先，使基因表达在细胞质中受空间限制；其次，在局部刺激下，mRNA精准定位可在刺激原位迅速调控翻译水平,高效实现细胞对刺激的应答反应；第三，RNA定位的模式对于细胞来说十分经济，定位于亚细胞的mRNA可被多次翻译，产生大量蛋白质[12]。由此可见，RNA精准定位对于细胞正常生理功能具有重要意义。

本研究初步描绘了hESCs中RNA的细胞核和细胞质定位图谱，揭示了hESCs中6万多个RNA的核质定位详情及特点，如细胞质中RNA类型丰富，可能由于细胞质为RNA翻译、RNA与蛋白质发挥功能的主要区域，大多数mRNA转录后被运输至细胞质进行翻译；也有很多ncRNA在胞质中可能发挥调控功能。而细胞核中定位大量mRNA，分析原因可能是转录后正在进行加工以及转运出核的RNA；也有一些成熟的mRNA定位于胞核中，这些mRNA可能是作为“备用池”(reserve pools)发挥功能，在细胞中有一些基因的转录以爆发的形式发生，而将这部分mRNA储存于核中可以缓冲胞质中这些转录本的水平，从而减少转录噪声带来的基因表达变异[13]；此外猜测可能有一部分mRNA在细胞核中具有某些调控功能。这些RNA定位特点对既往RNA核质定位认知进行了一定的补充。

同时发现特异性定位于细胞质的RNA多于细胞核，且这些RNA类型与整体定位的RNA类型不同，特异性定位于胞质中的mRNA占比很高，超过90%；而细胞核中也有很多mRNA特异性定位于此，占核中特异性RNA的41%，这些mRNA翻译的蛋白可能更倾向于定位至核散斑与核浆处来发挥功能[14]，也可能存在未知的调控功能，如NKTR在自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)中编码膜锚定的蛋白，存在于NK细胞表面促进它们与靶细胞的结合，但NKTR在hESCs中定位于细胞核，这提示该mRNA可能在hESCs中具有未知的功能。可见mRNA、ncRNA的核质定位不由RNA类型决定，更可能是通过其自身序列特点、结构特点或其他调控因子等调控其定位。

目前研究表明RNA的核质定位可通过多种因素共同调控实现，如RNA序列中的定位元件可调控RNA出核或滞留核中，如大部分mRNA的3′UTR区有出核序列，而很多长链非编码RNA中具有核滞留顺式元件，这些序列可被特定的RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)识别并结合，调控RNA出核或核滞留，使其准确定位并发挥功能。因此RNA的定位元件与转运RBP将共同调控RNA的定位，此外RNA的一些修饰水平、RNA选择性剪接、RNA3′端选择性加尾等也将影响RNA的核质定位[15]。研究这些RNA特异定位在细胞核与细胞质的机制是本课题进一步的研究方向。

综上，本研究展示了很多有趣新颖的RNA在细胞核和细胞质定位，全面描绘了hESCs细胞核和细胞质中RNA定位图谱，为进一步探索hESCs中RNA精确的定位图谱提供了基础。