聚合酶链反应技术建立巴尔通体的检测鉴定方法 并用于诊断临床疑似猫抓病合并双侧支气管肺炎患者分析

贾鹏霞 程江

【摘要】目的 探讨用聚合酶链反应（PCR）技术建立巴尔通体的检测鉴定方法并用于诊断临床疑似猫抓病合并双侧支气管肺炎患者的价值。方法 依据16S-23SrRNA ITS基因序列长于其他细菌，且此段基因序列当中的tRNAIle-tRNAAla基因间隔区的变异性高，而在巴尔通体属当中，tRNAIle、tRNAAla基因序列完全保守;此外，利用两对引物对一例可疑猫抓病患者的全血基因组DNA进行直接扩增。结果 通过开展序列分析得知，设计引物TIle.455p～TAla.885n扩增产物核昔酸序列一致于巴尔通体一分离株对应位置，同源性达到100%。结论 在血液中采用PCR技术实施直接扩增特异基因片段，能够对巴尔通体感染进行快速检测。

【关键词】聚合酶链反应技术;巴尔通体;猫抓病;双侧支气管肺炎

【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095.6681.2020.8..01

巴尔通体实为一群氧化酶呈阴性，革兰染色呈阴性，其不仅能诱发战壕热病，还能引起巴尔通体病（Carrion）、猫抓病（CSD）等[1-2]。本文构建基于聚合酶链反应（PCR）的巴尔通体感染检测方法，对1例发热肺炎患者的全血DNA进行检测，并从中将巴尔通体特异基因片段扩增出来，现对此分析如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

患者，男，48岁，在此次发病前，有典型的猫抓伤史;咳嗽、发热、胸痛为其典型临床表现;而经查体得知，猫抓伤侧的腋窝以及腹股沟淋巴结均存在肿大情况，且肝脾也存在肿大情况。

1.2 阳性对照菌株

本文所选用巴尔通体菌株TR222SM、RT221SM、RT225SM分离，都为鼠类动物血液，且均经中国疾预防控制中心用PCR及测序技术明确为巴尔通体。

1.3 提取全血DNA

取600 ?L血，加入到浓度为1%的SDS中，蛋白酶K（20 mg/mL）浓度0.2 mg/mL，RNase浓度为57 ?g/mL，充分混匀，水浴（55℃），分别用氯仿、饱和酚进行数次抽提，取上清液，离心处理（12000 r/min），将管中液体舍去，利用1 mL浓度为70%的乙醇对DNA进行清洗，沉淀二次，再离心10分钟，于-20℃保存。

1.4 引物

查找巴尔通体16S～23SrRNA基因间隔区（ITS）序列，借助DNAsis序列分析软件，开展多序列比较，设计引物TIle.455p～TAla.885n扩增16S～23SrRNA ITSs当中的tRNAIle与tRNAAla基因间隔区序列，扩增片段最小为300 bp，最大为500bp。

1.5 PCR反应及产物检测

在模板DNA中加入1?l的反应体系，以及1.5 ?L的Taq DNA聚合酶、1 ?L的引物、2 ?L的dNTP，另将适量离子水加入，使总量达25 ?L，采用PCR基因扩增仪（Robocycler Gradient 40型）。取扩增产物5 ?L，将电泳载样液1 ?L加入，另将琼脂糖电泳（1%）加入，时间为40分钟，紫外线灯照射，且进行拍照。

2 结 果

2.1 PCR结果

将全血基因组DNA作为模板，三对引物都扩增出阳性产物，而对于阳性对照，都扩增出特异基因片段，另外，空白对照都没有扩增带。针对引物BhCS.781～bhCS.1137n，其扩增出gltA基因380 bp片段;而对于引物Bh.311p～Bh.452n而言，其扩增出16S～23SrRNA ITSN'末端163bp片段;在本次研究当中，共扩增出片段451bp，与巴尔通体tRNAIle-tRNAAla基因间隔区预测带的大小相符。

2.2 核苷酸测序结果

引物Tile.455p～TAla.885n PCR擴增产物测序结果为，序列的长度为451bp，其中，针对1～75bp，其实为3'-端tRNAIle基因序列;而对于76～410bp，其则为tRNAIle-tRNAAla基因序列。通过开展序列分析得知，设计引物TIle.455p～TAla.885n扩增产物核昔酸序列一致于巴尔通体一分离株对应位置，同源性达到100%。

3 讨 论

巴尔通体属布鲁氏菌、根瘤菌目、α亚群及变形菌纲等高同源性。现阶段，已经发现19种巴尔通体，其中，多达7种能够引发人类疾病，如汉赛、五日热、杆菌样等[3]。伴随当今分子生物学及细菌分子遗传学检测方法的持续更新与完善，许多致病巴尔通体所造成的不良预后被发现且明确，人们对此种病原微生物所开展的研究日渐增多且深入。近年，伴随序列测定技术及PCR技术的不断发展，以及其在病原体检测中的不断应用，其为致病微生物鉴定，提供了一种实用且高效的手段。针对引物引物BhCS.781-bhCS.1137n而言，其能够扩增各种巴尔通体片段，而且还能实现与巴尔通体之间有较高同源性的根癌土壤杆菌等无扩增产物的扩增，因而是一种水平特异性。从本文研究结果可知，在血液中采用PCR技术实施直接扩增特异基因片段，可以对巴尔通体感染进行准确且快速的检测。

参考文献

[1] 叶 曦，姚美琳，李国伟.巴尔通体实验检测技术简介[J].中国人兽共患病学报，2017，23（11）：1160-1162.

[2] 王 琪.猫抓病2例临床病理分析[J].中国基层医药，2017，16（9）：1577-1578.