不明原因复发性流产患者接受淋巴细胞免疫治疗的效果预评估指标研究

陈丽莉 陈建安 朱学海 余晖 丁茜 刘晓彤

【摘要】 目的：探討对不明原因复发性流产患者的淋巴细胞免疫治疗效果具有预评估价值的指标，为免疫治疗提供临床参考。方法：选取2016年10月-2018年10月在笔者所在医院就诊并自愿接受淋巴细胞免疫治疗的不明原因复发性流产患者94例，比较相同治疗周期时，封闭抗体转为强阳性组与弱阳性组在治疗前外周血淋巴细胞亚群比例和治疗后两组的再发自然流产率差异;比较不同治疗周期时，封闭抗体经一疗程治疗转为阳性组与两疗程治疗转为阳性组的再发自然流产率差异。结果：相同治疗周期，封闭抗体强阳性组治疗前CD3+CD8+T淋巴细胞比例高于弱阳性组，差异有统计学意义（P<0.05）;封闭抗体强阳性组在孕16周前再发自然流产率低于弱阳性组，差异有统计学意义（P<0.05）;不同治疗周期，封闭抗体经一疗程治疗转为阳性组与两疗程治疗转为阳性组在孕16周前的再发自然流产率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：外周血CD3+CD8+T淋巴细胞可预评估免疫治疗后封闭抗体的阳性强度，而封闭抗体阳性强度与孕16周前的再发自然流产率相关。暂未发现封闭抗体转为阳性的治疗周期对孕16周前的再发自然流产率具有预评估价值。

【关键词】 封闭抗体 淋巴细胞亚群 不明原因复发性流产 淋巴细胞免疫治疗

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.12.006 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2020）12-00-03

Study on the Pre-evaluation Index of Lymphocyte Immunotherapy in Patients with Unexplained Recurrent Spontaneous Abortion/CHEN Lili， CHEN Jianan， ZHU Xuehai， YU Hui， DING Qian， LIU Xiaotong. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（12）： -16

[Abstract] Objective： To explore the indexes of pre-evaluation for lymphocyte immunotherapy in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion， and to provide clinical reference for immunotherapy. Method： From October 2016 to October 2018 in our hospital， 94 cases of patients with unexplained recurrent spontaneous abortion voluntarily accepted the lymphocyte immune treatment were selected. In the same treatment cycle，the differences in the proportion of peripheral blood lymphocyte subsets before treatment and the rate of recurrent spontaneous abortion after treatment were compared between the strongly and the weakly positive group with blocking antibody. In the different treatment cycle， the rate of recurrent spontaneous abortion in the positive group with blocking antibody after one course of treatment and the positive group after two courses of treatment were compared. Result： With the same treatment cycle， the proportion of CD3+CD8+T lymphocytes before treatment in the strongly positive group with blocking antibody was higher than that in the weakly positive group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The rate of recurrent spontaneous abortion in the strongly positive group with blocking antibody before 16 weeks of pregnancy was lower than that in the weakly positive group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. With the different treatment cycle， the rate of recurrent spontaneous abortion in the positive group with blocking antibody after one course of treatment and that after two courses of treatment was not statistically significant （P>0.05）. Conclusion： Peripheral CD3+CD8+T lymphocytes can pre-evaluate the positive intensity of blocking antibody after immunotherapy， and the positive intensity of blocking antibody is related to the rate of recurrent spontaneous abortion before 16 weeks of pregnancy. It is not found that the treatment cycle of blocking antibody to positive had a pre-evaluation value on the rate of recurrent spontaneous abortion before 16 weeks of pregnancy.

[Key words] Blocking antibody Lymphocyte subsets Unexplained recurrent spontaneous abortion Lymphocyte immunotherapy treatment

First-authors address： Donghua Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University， Dongguan 523000， China

国内多项研究认为，丈夫外周血淋巴细胞免疫治疗（lymphocyte immunotherapy treatment，LIT）可用于治疗不明原因复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[1-3]，其原理为LIT可诱导母体产生封闭抗体（blocking antibody，BA），BA能抑制母体免疫系统识别和杀伤胚胎，从而产生免疫保护作用[4-5]。尽管LIT的疗效得到普遍认同，但目前对预评估LIT疗效的指标少有报道，而预评估指标可指导治疗方案的制定，提高治疗效果。因此本次研究拟对笔者所在医院自愿接受LIT的URSA患者进行疗效追踪和相关指标回顾分析，旨在研究对LIT的治疗效果具有预评估价值的指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年10月-2018年10月在中山大学附属东华医院就诊且自愿接受LIT的URSA患者94例。纳入标准：女方连续3次以上自然流产且封闭抗体阴性;通过分泌物检查排除生殖器感染;通过超声或宫腔镜排除生殖器异常及其他病变;抗子宫内膜抗体、抗卵巢抗体、抗绒毛膜促性腺激素抗体、抗精子抗体、抗心磷脂抗体、抗核抗体、抗双链DNA抗体均为阴性;凝血功能正常。男方精液常规正常、抗精子抗体为阴性。同时，夫妻双方的支原体、衣原体、乙肝病毒、HIV、梅毒抗体、TORCH-IgM病毒抗体均为阴性;染色体核型分析正常且非近亲结婚;研究对象以往均未接受过淋巴细胞主动免疫治疗。排除标准：合并其他基础疾病;通过人工辅助妊娠。患者年龄24～42岁，平均（31.0±4.7）岁，流产3～7次，平均（4.2±0.9）次。治疗前夫妻双方均对LIT充分了解并签署知情同意书。本次研究通过医院伦理委员会审批。

1.2 方法

1.2.1 BA检测 采集患者肘静脉血2 ml，分离血清，采用酶联免疫吸附试验进行外周血BA检测，每次检测均设阴性、阳性和空白对照，检测步骤及结果判读严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 外周血淋巴细胞亚群检测 采集患者肘静脉血2 ml，EDTA-K2抗凝，分别取抗凝全血50 μl加入4个流式细胞计数试管中，再往第1管加入CD45-FITC/CD3-PC5/CD8-ECD/CD4-RD1抗体各5 μl，第2管加入CD45-FITC/CD19-ECD/CD56-RD1抗体各5μl，第3管加入CD45-Cy7/CD4-PE/CD25-FITC抗体各5 μl，第4管加入CD45-FITC/CD3-PC5/CD16-PE/CD56-RD1抗体各5 μl，避光反应20 min后，加入红细胞裂解液500 μl，避光反应20 min后加入PBS缓冲液，用流式细胞仪分析计算淋巴细胞亚群比例。

1.2.3 淋巴细胞免疫治疗（LIT） 采集淋巴细胞供给者外周血30 ml（肝素钠抗凝），缓缓加入到20 ml淋巴细胞分离液中，2 000 r/min离心30 min，收集中间层细胞放入含6 ml生理盐水的试管中混匀，2 000 r/min离心5 min，弃去上清后用生理盐水反复洗涤沉淀物2次，最后配制成浓度为2×107～4×107/ml的淋巴细胞悬液。取淋巴细胞悬液在患者手臂内侧进行8～10个点皮内注射。每3周1次，4次为一个疗程，治疗一疗程后复查BA，BA转为阳性即指导妊娠，妊娠后每2周进行LIT一次，妊娠10周后调整治疗方案为每3周进行LIT一次，妊娠16周治療结束。治疗一疗程后BA仍未转为阳性者，继续第二疗程治疗后再指导妊娠。

1.3 观察指标

分别观察LIT前患者外周血淋巴细胞亚群比例与LIT后BA阳性强度;BA阳性强度与LIT后患者再发自然流产率;BA转为阳性的LIT疗程与LIT后患者再发自然流产率。

1.4 统计学处理

采用统计学软件SPSS 17.0进行数据分析。计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 相同治疗周期BA强阳性组与弱阳性组在治疗前外周血淋巴细胞亚群比例比较

经一疗程治疗后，48例患者的BA转为强阳性，22例患者的BA转为弱阳性，强阳性组治疗前CD3+CD8+T细胞比例高于弱阳性组，差异有统计学意义（P<0.05），而两者的CD3+T、CD3+CD4+T、CD4+CD25+T、CD19+B、CD56+CD16+NK、CD56+CD16-NK等淋巴细胞比例差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2 相同治疗周期BA强阳性组与弱阳性组再发自然流产率比较

经一疗程治疗后，BA转为强阳性者占68.6%（48/70），弱阳性者占31.4%（22/70）。BA强阳性组年龄24～40岁，平均（31.1±4.9）岁，流产3～6次，平均（4.2±0.8）次;BA弱阳性组年龄25～42岁，平均（31.5±4.6）岁，流产3～6次，平均（4.3±0.8）次。两组患者的年龄及流产次数比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

BA强阳性组中，36例再次妊娠，其中15例在孕期中且孕周超过16周，15已经分娩，2例在孕16周前再次发生自然流产，1例因染色体异常引产及3例孕周小于16周不列入统计范畴，BA强阳性组孕16周前再发自然流产率为6.3%（2/32）。BA弱阳性组中，20例再次妊娠，其中9例在孕期中且孕周超过16周，3例已经分娩，6例在孕16周前再次发生自然流产，2例孕周小于16周不列入研究范畴，BA弱阳性组孕16周前再发自然流产率为33.3%（6/18）。BA强阳性组在孕16周前再发自然流产率低于BA弱阳性组，差异有统计学意义（字2=4.434，P=0.035）。

2.3 BA一疗程转为阳性组与两疗程转为阳性组的再发自然流产率比较

94例患者中，70例经一疗程治疗后BA转为阳性，22例经两疗程治疗后BA转为阳性，2例经两疗程治疗后BA仍为阴性。一疗程组年龄24～42岁，平均（31.3±4.5）岁，流产3～6次，平均（4.3±0.8）次;两疗程组年龄25～41岁，平均（30.7±4.3）岁，流产3～7次，平均（4.1±1.0）次，两组患者的年龄及流产次数比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

在BA转为阳性的患者中，一疗程组中56例再次妊娠，其中24例在孕期中且孕周超过16周，18例已分娩，8例在孕16周前再次发生自然流产，1例因染色体异常引产以及5例孕周小于16周均不列入统计范畴，一疗程组孕16周前再发自然流产率为16%（8/50）。两疗程组中16例再次妊娠，其中7例在孕期中且孕周超过16周，5例已分娩，2例在孕16周前再次发生自然流产，2例孕周小于16周不列入统计范畴，两疗程组孕16周前再发自然流产率为14.3%（2/14）。两组患者孕16周前再发自然流产率相比，差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是临床常见的妇科疾病，对女性患者带来极大的身心伤害，现已成为目前医学上急需解决的医学难题之一[6]。在复发性流产的众多病因中，同种免疫异常所占比例最高[7]，同种免疫型复发性流产又被称为不明原因复发性流产（URSA）。石瑛等[8]通过进行反复自然流产与BA相关性的Meta分析，认为URSA与BA缺乏有关。BA是妊娠女性血清中含有的针对胚胎人类白细胞抗原Ⅱ和滋养细胞交叉抗原产生的IgG抗体，通过与滋养细胞结合或与母体淋巴细胞表面抗原结合，防止胚胎父系抗原被母体免疫系统识别触发的免疫攻击[9]。研究显示，对BA缺乏的URSA患者，经LIT治疗后，可诱导BA产生，进而提高淋巴细胞的封闭率，致使调节性T细胞得到活化和增殖[10]，从而抑制母胎之间的免疫排斥，最终使妊娠率及活产率均显著升高[11]。然而尽管大多研究证实LIT对URSA患者治疗效果明显[12]，但遗憾的是目前对LIT疗效的预评估缺乏相关研究，如对LIT疗效预评估指标进行探讨，则可进一步细化LIT治疗方案，提高治疗效果。LIT主要是通过诱导BA产生而发挥治疗效果，但诱导产生的BA的阳性强度差异是否影响再发自然流产率;BA阳性强度差异的治疗前影响因素有哪些;经不同治疗周期诱导产生BA的患者的再发自然流产率是否有差异等，这些都是临床需要探讨的问题，同时亦可为预评估治疗效果提供参考。因此本次研究通过对比在相同治疗周期内，BA转为强阳性组与转为弱阳性组患者在治疗前外周血淋巴细胞亚群比例，发现前者CD3+CD8+T淋巴细胞比例高于后者，差异有统计学意义，而治疗后BA强阳性组在孕16周前的再发自然流产率低于弱阳性组，差异有统计学意义（P<0.05）。在不同治疗周期内，BA经一疗程治疗转为阳性组与两疗程治疗转为阳性组患者比较，两者孕16周前的再发自然流产率差异无统计学意义（P>0.05）。

外周血淋巴细胞亚群是人体细胞免疫的重要因素，CD3+CD8+T和CD3+CD4+T是T淋巴细胞的主要组成部分，CD3+CD8+T淋巴细胞主要对CD3+CD4+T淋巴细胞参与的细胞免疫产生抑制[13]。本次研究发现，治疗后BA转为强阳性组在治疗前CD3+CD8+T淋巴细胞比例高于BA转为弱阳性组，推测CD3+CD8+T淋巴细胞可能间接影响BA的产生，因此推荐治疗前使用CD3+CD8+T淋巴细胞比例预评估LIT诱导BA产生的阳性强度。BA作为一种体液免疫因素，被认为是妊娠成功的一个重要因素[14]。本次研究发现BA强阳性组孕16周前的再发自然流产率低于弱阳性组，提示BA的阳性强度与再发自然流产率相关，建议LIT后观察BA的阳性强度，对于BA弱阳性的患者，进行巩固治疗后再指导妊娠，可进一步降低再发自然流产率。另外，本次研究暂未发现BA转为阳性的治疗周期与孕16周前的再发自然流产率相关，治疗周期能否预评估治疗效果尚需更多研究数据论证。

参考文献

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[9]吴培莉，薛晴.不明原因复发性流产的免疫治疗策略[J].中国计划生育学杂志，2018，26（12）：1259-1264.

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（收稿日期：2020-02-21） （本文编辑：张亮亮）