芪贞降糖颗粒对糖尿病肾病大鼠TGF-β1/Smad信号通路的调控作用

何云娇，张骊敏，方朝晖，姜 辉，刘晓闯，孙 菁

(1.安徽中医药大学第一附属医院 国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽 合肥 230031；2.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见的并发症，以高血糖、蛋白尿、水肿等为临床表现，具有发病率高、病因机制复杂多样等特点[1-2]。DN是引发终末期肾病的主要原因之一，也是导致肾衰竭的重要因素。其主要病理基础是肾组织间质纤维化增生及肾小球硬化症。转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)是引发纤维化增生的关键因子，Smad蛋白是TGF-β1受体细胞内激酶的作用底物，也是导致肾损害的重要因子[3-4]。芪贞降糖颗粒为安徽中医药大学第一附属医院治疗糖尿病的特色院内制剂，由黄芪、女贞子、生晒参、黄连、山茱萸、五倍子等组成，临床应用多年，质量稳定，疗效明确[5-7]。芪贞降糖颗粒能够降低糖尿病患者血糖水平，减轻DN血管病变程度，但其具体作用机制尚不清楚。因此，本实验通过研究芪贞降糖颗粒对TGF-β1/Smad信号通路的调节作用，探讨其改善DN的作用机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 SD大鼠，雄性，清洁级，体质量(200±20)g，购于安徽医科大学实验动物中心[生产许可证号：SCXK(皖)2011-0002]。

1.2 药物 芪贞降糖颗粒(黄芪30 g，女贞子、山茱萸各12 g，生晒参9 g，五倍子6 g，黄连5 g)为安徽中医药大学第一附属医院院内制剂，批号：20180621；二甲双胍片(每片0.25 g，每盒48片)，上海信谊天平药业有限公司，批号：67190605。

1.3 试剂 链脲佐菌素(streptozocin，STZ)(批号 SLBB8126V)：美国 Sigma；DAPI染色液、抗荧光淬灭封片液：Beyotime公司；Revert AidTM逆转录试剂盒(批号 00691399)：Thermo；PVDF膜(批号 R8CA8257E)：Millipore公司；超敏发光(enhanced chemiluminescent，ECL)试剂盒(批号 SF249607)：Thermo公司。

1.4 仪器 JW-3021HR型高速冷冻离心机：安徽嘉文仪器装备有限公司；RT-PCR仪：美国Thermo Scientific；微量移液器：德国Eppendorf；RM2016病理切片机：上海徕卡仪器有限公司；ZT-12M自动脱水机、YB-7LF组织包埋机：湖北亚光医用电子技术有限公司；全自动生化分析仪：美国Beckman公司；BA410E荧光显微镜：中国Motic公司。

2 方法

2.1 动物模型复制 80只雄性SD大鼠适应性饲养1周后，随机选取10只为正常对照组，以常规饲料饲养，其余大鼠给予高脂饲料饲养。喂养4周后，禁食12 h，高脂饲料饲养大鼠按照35 mg/kg腹腔注射STZ(使用前以0.1 mmol/L、pH4.2的柠檬酸缓冲液配制成1% STZ溶液，现用现配)。正常对照组注射等容积的柠檬酸缓冲液。1周后尾静脉无菌操作后取血，测定大鼠空腹血糖，以血糖值≥16. 7 mmol/L作为模型复制成功的标准[8-9]。

2.2 分组及给药 将模型复制成功的大鼠随机分为模型组，二甲双胍组，芪贞降糖颗粒低、中、高剂量组，每组10只。其中二甲双胍组灌胃二甲双胍180 mg/kg，芪贞降糖颗粒低、中、高剂量组根据前期研究[5]，分别灌胃50、100、200 mg/kg芪贞降糖颗粒，各组每日灌胃给药1次，连续8周，期间各组大鼠自由饮食饮水，模型组和正常对照组分别灌服等量溶媒。

2.3 尿α1微球蛋白，β2微球蛋白和白蛋白含量测定 实验结束前，将各组大鼠放入代谢笼中收集24 h尿液，经全自动生化分析仪测定尿α1微球蛋白、β2微球蛋白和白蛋白含量。

2.4 肾组织病理形态学观察 采用3.5%的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠，取相同部位的肾皮质，放置在10%的中性甲醛溶液中固定，经乙醇脱水处理，二甲苯透明，常规石蜡包埋，制成3 μm厚切片，苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色后观察肾组织病理形态学的变化。

2.5 免疫荧光检测肾组织TGF-β1和转化生长因子βⅠ型受体(transforming growth factor beta type Ⅰ receptor，TGF-βRⅠ)的分布表达 取相同部位肾组织， 经切片脱蜡，抗原修复，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)洗涤，封闭处理后，滴加一抗孵育1 h，PBS冲洗后滴加荧光二抗避光孵育20 min，甩干，经4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)复染5 min，加入抗荧光淬灭封片剂封片处理，置于荧光显微镜下观察切片并采集图像。

2.6 RT-PCR技术检测肾组织TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad3和Smad7 mRNA表达 取各组大鼠肾脏组织50 mg，按照Trizol 法提取肾皮质总RNA，经逆转录酶反转录合成cDNA。引物由Sangon Biotech公司合成。引物序列见表1。实验结果以目标基因与β-actin 相对表达量表示。

表1 引物序列

2.7 Western blot法检测肾组织TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad3、p-Smad3、Smad7和p-Smad7蛋白表达水平 取肾脏组织适量，碾磨破碎处理，提取大鼠肾皮质总蛋白，湿式电转印至PVDF膜，牛血清白蛋白封闭，TBST洗膜处理，然后分别加入一抗，4 ℃缓慢摇晃，孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，孵育2 h，洗膜后经ECL发光法进行鉴定，通过凝胶成像系统扫描分析定影后条带吸光度值。以各蛋白条带与内参β-actin吸光度值之比表示蛋白的相对表达量。

3 结果

3.1 芪贞降糖颗粒对大鼠尿α1微球蛋白、β2微球蛋白和白蛋白的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠尿α1微球蛋白、β2微球蛋白及白蛋白含量均明显升高(P<0.05)；给药8周后，与模型组比较，二甲双胍组，芪贞降糖颗粒中、高剂量组大鼠尿液α1微球蛋白、β2微球蛋白及尿白蛋白含量均显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 芪贞降糖颗粒对大鼠α1微球蛋白、β2微球蛋白和尿白蛋白的影响

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.2 芪贞降糖颗粒对大鼠肾组织形态的影响 HE染色观察可见，正常对照组大鼠肾小球形态正常，肾小球基底膜未见明显异常，肾小管结构完整，排列整齐；模型组大鼠肾小球基底膜厚度明显增加，肾小球体积变小，肾小管上皮细胞存在空泡化现象。芪贞降糖颗粒组大鼠肾小球形态基本正常，基底膜存在轻微增生，肾小管排列趋于完整，存在少数上皮细胞空泡化改变，病变程度较模型组明显减轻。见图1。

注：A.正常对照组；B.模型组；C.二甲双胍组；D.芪贞降糖颗粒低剂量组；E.芪贞降糖颗粒中剂量组；F.芪贞降糖颗粒高剂量组

图1 芪贞降糖颗粒对大鼠肾组织形态的影响(HE染色，10×20倍)

3.3 芪贞降糖颗粒对大鼠肾组织TGF-β1和TGF-βRⅠ分布的影响 免疫荧光结果显示：蓝色荧光部分为细胞核表达，绿色荧光部分为TGF-β1和TGF-βRⅠ在肾组织的分布与表达。与正常对照组比较，模型组大鼠肾组织TGF-β1和TGF-βRⅠ分布明显增多，主要分布在肾小球内；与模型组比较，芪贞降糖颗粒组TGF-β1和TGF-βRⅠ分布明显降低，表明芪贞降糖颗粒在一定程度上能够降低TGF-β1和TGF-βRⅠ在肾组织的分布与表达。见图2、图3。

注：A.正常对照组；B.模型组；C.二甲双胍组；D.芪贞降糖颗粒低剂量组；E.芪贞降糖颗粒中剂量组；F.芪贞降糖颗粒高剂量组

图2 芪贞降糖颗粒对大鼠肾组织 TGF-β1荧光表达的影响

注：A.正常对照组；B.模型组；C.二甲双胍组；D.芪贞降糖颗粒低剂量组；E.芪贞降糖颗粒中剂量组；F.芪贞降糖颗粒高剂量组

图3 芪贞降糖颗粒对大鼠肾组织TGF-βRⅠ荧光表达的影响

3.4 芪贞降糖颗粒对大鼠肾组织TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad3和Smad7 mRNA表达水平的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠肾组织TGF-β1、TGF-βRⅠ和Smad3表达水平明显增加，Smad7表达水平明显降低(P<0.05)；与模型组比较，芪贞降糖颗粒组低、中、高剂量组和二甲双胍组大鼠肾组织TGF-β1、TGF-βRⅠ和Smad3表达水平明显降低，Smad7表达水平明显增加，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 芪贞降糖颗粒对大鼠TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad3和Smad7 mRNA表达水平的影响

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.5 芪贞降糖颗粒对大鼠肾组织TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad3、p-Smad3、Smad7和p-Smad7蛋白表达水平的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠肾组织TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad3和 p-Smad3表达水平明显增加，Smad7和p-Smad7表达水平明显降低(P<0.05)；与模型组比较，芪贞降糖颗粒低、中、高剂量组和二甲双胍组均能不同程度地降低TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad3和 p-Smad3表达水平，升高Smad7和p-Smad7的表达水平，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表4、图4。

表4 芪贞降糖颗粒对大鼠肾组织TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad3、p-Smad3、Smad7和p-Smad7蛋白表达水平的影响

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

DN是糖尿病常见的一种微血管并发症，具有高血糖、高血压、高蛋白尿的显著特征。其具体发病机制目前仍不完全清楚，一般认为多与遗传、环境、炎症反应、糖脂代谢紊乱以及自身免疫性疾病等有关[10-11]。DN主要病变部位在肾小球，主要表现为基底膜厚度增加和系膜细胞基质进行性积聚，易引发肾小球硬化症及终末期肾衰竭病变[12]。芪贞降糖颗粒由黄芪、女贞子、山茱萸、生晒参等组成，组方精炼合理，临床应用多年，疗效确切，常用于治疗气阴两虚型消渴症，具有降低血糖、血脂，改善DN等作用，是治疗糖尿病及其代谢综合征的常用药物。

注：A.正常对照组；B.模型组；C.二甲双胍组；D.芪贞降糖颗粒低剂量组；E.芪贞降糖颗粒中剂量组；F.芪贞降糖颗粒高剂量组

图4 各组大鼠肾组织TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad3、p-Smad3、Smad7和p-Smad7蛋白表达水平比较

TGF-β1/Smad是引发DN的主要通路之一，能够加剧DN症状的产生[13-14]。TGF-β1/Smad信号通路由TGF-β1、TGF-βRⅠ及受体底物Smad蛋白家族信号分子构成。TGF-β1是一种内分泌蛋白分子，能够促进纤维化进程，在肾纤维化和系膜细胞基质积聚方面具有重要作用。正常生理条件下，TGF-β1与TGF-β受体形成受体复合物，从而激活Smad蛋白分子，完成信号通路由细胞质向细胞核的正常传递。Smad分为Smad2、Smad3、Smad7 3种形态。其中Smad2和Smad3是调节型受体，位于其末端的丝氨酸残基易被TGF-β1受体激酶产生磷酸化效应而激活，调节细胞核信号通路传递而发挥转录效应[15]。Smad7是Smad家族中的抑制型受体，能够降低TGF-βRⅠ对Smad3的磷酸化效应，从而阻断TGF-β1/Smad信号通路的传递，减轻肾组织纤维化程度，从而改善DN症状。

有研究指出，在DN大鼠肾组织中Smad3表达呈增加趋势，Smad7表达呈降低现象，经药物治疗后，上述现象存在一定程度的逆转，表明通过调控TGF-β1/Smad信号通路能够在一定程度上起到治疗DN的作用[16-17]。本实验结果证实，DN模型大鼠TGF-β1、TGF-βRⅠ和Smad3表达显著增加，Smad7表达显著降低，从而导致DN的发生。给予芪贞降糖颗粒治疗后，TGF-β1、TGF-βRⅠ和Smad3表达明显降低，Smad7表达明显升高，该结果表明芪贞降糖颗粒能够通过改善TGF-β1/Smad信号通路蛋白活性，起到治疗DN的作用，其结果与文献报道一致。

综上所述，芪贞降糖颗粒能够减轻DN大鼠肾组织病理损伤程度，改善肾功能，起到减缓DN的作用，其机制可能与调控TGF-β1/Smad信号通路蛋白表达有关。