雷公藤红素对人肺癌A549细胞增殖活性及能量代谢的影响

王淑静，訾庆雪，付玉，刘琳，张文君，张家宁

(哈尔滨商业大学药学院，黑龙江哈尔滨150076)

肺癌是一种临床上常见的呼吸系统的恶性疾病，在我国肿瘤的发病率和死亡率中均居前列，其发病率呈逐年上升趋势，对患者的生命安全造成了严重威胁[1-2]。目前，肺癌的化疗主要采用铂类药物，如顺铂或卡铂，但多次使用后会出现耐药性，并且患者化疗后生活质量较差[2]。因此，寻找行之有效的药物及治疗途径对肺癌治疗至关重要。

雷公藤红素(celastrol)是卫矛科植物雷公藤的主要活性成分之一，为醌甲基型五环三萜类化合物，分子式为C29H38O[3-4]，雷公藤红素具有抗肿瘤、抗炎与抑制免疫、抑制血管生成、抗神经退行性疾病、抗病毒、抗动脉粥样硬化等药理活性[5-7]。研究表明，雷公藤红素具有良好的抗肿瘤活性，本文选取人肺癌细胞A549，从能量代谢的角度研究雷公藤红素对肿瘤细胞的增殖抑制和促凋亡的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

1.1.1 主要材料 人肺癌细胞株(A549)，哈尔滨商业大学药学院保存；雷公藤红素(纯度≥99.5%)，购于中国科学院成都研究所；RPMI 1640培养液、胎牛血清、胰蛋白酶，购于Invitrogen公司；己糖激酶试剂盒、丙酮酸激酶试剂盒、乳酸脱氢酶试剂盒、琥珀酸脱氢酶试剂盒及ATP含量测定试剂盒，购于南京建成生物工程研究所。

1.1.2 主要仪器 MR-96A酶标仪酶标仪购自深圳迈瑞生物医疗股份有限公司；Mco-15AC CO2培养箱购自日本Sanyo El公司；3K30低温离心机购自美国Sigma公司；CKX 41SF倒置显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 细胞培养 人肺癌细胞株(A549)在含有10%胎牛血清及1%青链霉素的RPMI 1640完全培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，2～3 d传代1次。待细胞稳定生长后，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.3 MTT法 取对数生长期的A549细胞，PBS漂洗，胰酶消化，调整细胞浓度为5×104个/mL。取96孔板，四周铺100μL PBS，其余孔加细胞悬液100 μL，置于37℃，5%CO2培养箱培养24 h后，弃原培养液，各孔加由无血清的1640培养液配置雷公藤红素，浓度梯度为 1.5、2、2.5、3、3.5、4 μg·mL-1，阳性对照组加5-FU(10μg·mL-1)，空白对照组加等体积无血清培养基，每组设置3个复孔，继续培养48 h。 每孔加10μL MTT(5 μg·mL-1)培养 4 h，弃原液，每孔加150μL DMSO。490 nm酶标仪测吸光度值。计算细胞抑制率及IC50。

1.4 生长曲线 取对数生长期的A549细胞，PBS漂洗，胰酶消化，调整细胞浓度为5×104个/mL，取24孔板每孔加400μL细胞悬液，37℃培养24 h。弃原培养液，雷公藤红素组、空白对照组分别加入400μL雷公藤红素(终浓度为3μg·mL-1)和无血清培养基，每组设置3个复孔，继续培养24 h。台盼蓝(0.04%)溶液染色，光镜下细胞计数。每天取3个孔，每孔计数3次，求平均值，以活细胞数为纵坐标，培养时间为横坐标绘制生长曲线图。

1.5 HE染色 取对数生长期的A549细胞，胰酶消化制成细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/mL，接种于带有盖玻片的6孔板中，每孔1 mL，培养24 h，吸弃原培养液，每孔加入400μL雷公藤红素(终浓度为3μg·mL-1)，空白组加入400μL无血清培养基，继续培养48 h。弃原液，取出盖玻片，依次使用苏木精染液和伊红染液染色，37℃培养箱中干燥24 h后显微镜下观察，具体方法参照文献[8]。

1.6 能量代谢相关酶活力及代谢产物含量测定取对数生长期的A549细胞，PBS漂洗，胰酶消化，调整细胞浓度为2×105个/mL，取 接种于25 cm2培养瓶中培养24 h。实验分组及给药浓度同“1.5”项下，继续培养48 h。经胰酶消化后吹打成细胞悬液，2 000 rpm离心5 min，弃上清。加0.9%生理盐水重悬、离心，重复操作两次。一般样品处理将细胞悬液加入石英细胞匀浆器中，0℃手动匀浆6～8次，每次匀浆1 min，间隔30 s。ATP样品处理将细胞悬液(不少于106个)加入300μL热双蒸水中，沸水浴中破碎后继续加热10 min。BCA法测定各组样品蛋白浓度。根据试剂盒测定HK、PK、LDH和SDH的活力以及ATP含量，具体操作见试剂盒说明书和文献[8]。

1.7 统计与分析 采用SPSS 19.0统计分析软件，结果均数±标准差表示，数据采用完全随机分组设计的多样本均数比较进行统计学处理，P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 雷公藤红素的浓度选择 实验测得，10 μg·mL-1的5-FU对A549的抑制率为48.84%。由表1可知，雷公藤红素对A549的抑制作用较强，当雷公藤红素的浓度在2μg·mL-1时，对A549细胞的抑制率达到62.71%，远远大于阳性药组5-FU，当雷公藤红素浓度大于2μg·mL-1时，抑制率无明显差异，结合前期的其他细胞实验，选用3μg·mL-1的雷公藤红素浓度作为后续实验的给药浓度。

表1 雷公藤红素对A549增殖活性影响

2.2 生长曲线法检测细胞增殖 如图1所示，对照组A549细胞随时间增加，细胞浓度升高，在第6天浓度最高，与对照组比较，雷公藤红素作用24 h细胞浓度降低，随着雷公藤红素作用时间的延长，细胞增殖抑制作用明显，细胞数量逐渐减少，在第4天细胞浓度最低，第6天细胞抑制程度最明显。

2.3 HE染色法观察细胞形态 如图2所示，在40×镜下观察，对照组A549细胞形态为梭形，而雷公藤红素组A549细胞形态发生改变，主要体现为细胞边缘变亮、形态变圆、体积减小、核深染、胞质凝集且颜色变深。

2.4 酶活力及ATP含量测定 己糖激酶、丙酮酸激酶是糖酵解中两个重要的关键酶，乳酸脱氢酶可将丙酮酸转化为糖酵解的终产物乳酸，决定细胞的酸性环境，雷公藤红素组与对照组相比，乳酸脱氢酶活力显著下降(P＜0.01)，对于己糖激酶和丙酮酸激酶活力来说，雷公藤红素组与对照组相比没有显著差异(P＞0.05)，说明雷公藤红素对己糖激酶和丙酮酸激酶作用不敏感，影响较小；对于三羧酸循环的标志酶琥珀酸脱氢酶活力来说，雷公藤红素组显著下降(P＜0.05)。从总体ATP含量来说，对照组和雷公藤红素组细胞内每克蛋白中ATP含量分别为2 438.03 μmol、1 065.43 μmol，雷公藤红素组 ATP含量显著降低(P＜0.05)。因此雷公藤红素能够抑制糖酵解中的乳酸脱氢酶和三羧酸循环中的琥珀酸脱氢酶活力，进而减少ATP生成。

表2 雷公藤红素对A549细胞HK、PK、LDH以及SDH活力的影响(U·g-1)

3 讨论

肿瘤是危害人类健康的主要疾病，越来越多的研究表明许多天然中药活性成分由于其易合成、毒副作用低、疗效稳定等特点，有望成为未来理想的抗肿瘤药物[9]。雷公藤红素能通过抑制蛋白酶体活性而诱导肿瘤细胞凋亡，也有强抗氧化作用和抗肿瘤血管生成作用[10]。本实验使用雷公藤红素处理人肺癌A549细胞，通过检测细胞增殖和凋亡情况、能量代谢相关酶活力和代谢产物含量，来探究雷公藤红素对A549肺癌细胞的增殖抑制和相关机制。

MTT结果显示，雷公藤红素对人肺癌细胞A549具有增殖抑制作用。当雷公藤红素的浓度为2 μg·mL-1时，抑制率达到62.71%，高于阳性药5-FU(10μg·mL-1)的48.84%，认为雷公藤红素具有较强的抗肿瘤活性。但是当浓度大于2μg·mL-1时，细胞抑制率影响很小，各浓度之间抑制率无明显变化，结合前期对血管内皮细胞HUEVC、胃癌细胞SGC-7901细胞的实验，确定最终的给药浓度为3 μg·mL-1。生长曲线连续6 d观察雷公藤红素对细胞增殖的影响，结果显示，随着给药时间的延长，细胞浓度降低，具有时间依赖性，在第1天细胞数量开始下降，在第4天细胞浓度最低，在第6天抑制程度最明显。HE染色结果表明，药物处理后细胞数量减少，细胞形态发生变化，体现为细胞变圆、体积变小、胞质凝缩等，说明雷公藤红素对A549细胞的增殖能够发挥抑制作用。以上3种实验结果均显示雷公藤红素抑制人肺癌细胞A549的增殖作用明显。

肿瘤细胞的生长和繁殖旺盛，与普通细胞相比，所需营养物质的量更多。糖酵解和氧化磷酸化是细胞进行能量代谢的主要途径，对于普通细胞来说，当氧气充足时，葡萄糖经彻底氧化产生32分子的ATP；当氧气供应不足时，仅通过糖酵解产生2分子的ATP，因此只有在缺氧的条件下，正常细胞才会使用这种低产能的方式进行能量供应。但是在1923年，Warburg博士提出，与正常细胞相比，癌细胞内葡萄糖摄取和糖酵解速率显著增加。高速糖酵解快速产生ATP，并且不再偶联线粒体氧化代谢，产生的丙酮酸大多数由乳酸脱氢酶催化，在细胞质基质中转化为乳酸。即使在氧气充足支持线粒体呼吸的情况下，肿瘤细胞仍青睐糖酵解作为主要的产能途径[11]。因此，肿瘤细胞常出现葡萄糖摄取量增高、糖酵解增加和乳酸堆积等现象。乳酸脱氢酶催化丙酮酸生成糖酵解的终产物乳酸，不仅为肿瘤的生长和转移提供有利的酸性微环境，也与肿瘤耐药性密切相关[12]，实验结果表明，雷公藤红素对细胞内的LDH的活力有抑制作用，抑制丙酮酸转化成乳酸，可能会破坏肿瘤的酸性微环境。琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环的关键酶之一，也是线粒体的标志酶，主要催化琥珀酸生成延胡索酸并伴有能量的生成。实验结果表明，雷公藤红素对A549细胞内的SDH活性有显著的抑制作用，进而对肿瘤细胞A549内的氧化磷酸化过程产生影响。但是雷公藤红素对HK和PK活力无明显影响。ATP是最主要的供能物质，肿瘤的增殖侵袭等生理活动离不开ATP。雷公藤红素组中的ATP含量明显下降，推测雷公藤红素可能通过干预能量生成，进而达到抑制细胞增殖的作用。

综上所述，雷公藤红素可能通过影响糖酵解和氧化磷酸化过程中的酶活力，导致ATP合成减少，从而干扰肿瘤细胞能量代谢，发挥对人肺癌A549细胞的增殖抑制作用。