海南部分地区猪场胞内劳森氏菌流行情况调查

梅小伟，谭 涛，肖海君，索熊熊,方六荣

[1 礼蓝(上海)动物保健有限公司，上海 200041；2 华中农业大学，湖北 武汉 430070]

猪增生性肠炎又称猪回肠炎，是由胞内劳森氏菌引起的以回肠和结肠隐窝内未成熟的肠上皮细胞发生瘤样增生为特征的猪接触性肠道疾病。自1931年首次报道该病以来，全世界主要养猪国家如澳大利亚、比利时、美国、日本、丹麦、泰国以及中国都有其感染和流行的报道[1-2]，给养猪业造成了严重损失。有研究表明：由于回肠炎的影响，每头猪的成本增加2英镑(欧洲)，感染猪与未感染猪日增重有100 g左右的差异，料肉比增加0.2～0.4，出栏期延长7 d～10 d，死亡率为1%～6%，临床上可持续6～8周，淘汰率达15%。

根据临床症状，猪回肠炎主要分为三种类型：急性型、慢性型和亚临床型；其中急性回肠炎也称出血性肠炎，主要发生于3～12月龄的育肥猪或后备猪，表现为血痢，初期粪便为暗褐色，随即变成红色，引起猪突然死亡；慢性回肠炎也叫腺瘤样增生性肠炎，一般发生于6～20周龄的猪，临床症状主要有腹泻、生长缓慢、料肉比升高和猪群整齐度差，病情严重时残次猪的比例大幅升高。亚临床型回肠炎多发生于6～20周龄的猪，一般在母源抗体消失后的保育阶段开始暴发，一直到育肥期的晚期。临床上并不表现出腹泻症状，采食量及粪便正常，但猪的生长缓慢，影响料肉比及日增重[3]。为了解猪增生性肠炎在海南地区猪场中的流行状况，为其综合防制提供科学依据，本试验采集海南省部分地区14家猪场不同日龄猪的粪便，利用PCR方法调查胞内劳森氏菌的感染状况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

本试验样品来自海南省部分地区的2家自繁自养母猪场和12家育肥猪场共计14家猪场不同年龄段猪的粪便，共计348份。

1.1.2 试剂

粪便中胞内劳森氏菌的DNA提取试剂盒(Stool DNA Kit)为OMEGA公司生产，PCR检测试剂盒由北京擎科新业生物技术有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 粪便DNA提取

按照试剂盒相关操作说明提取粪便中胞内劳森氏菌的DNA，提取的DNA可小量分装于-80 ℃低温下保存备用。

1.2.2 胞内劳森氏菌特异性序列的扩增

采用普通的PCR方法，参考T. La等[4]推荐的方法合成1对特异性引物。胞内劳森氏菌预期扩增产物长度为655 bp，上游引物P1：5’-GATAATCTACCTTCGAGACGG-3’；下游引物 P2：5’-TGACCTCAGTGTCAGTTATCGT-3’。

反应体系为25 μL：Mix 10.5 μL，上游引物和下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，用RNase-free Water补至25 μL。

扩增程序：95 ℃变性5 min；进入PCR循环，95 ℃变性30 s，58 ℃退火90 s，72 ℃延伸120 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

提取胞内劳森氏菌总DNA，PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，阳性对照获得大小为655 bp左右的片段，与设计长度一致。1～6号为部分检测样品，在655 bp左右有带(图1)，判为胞内劳森氏菌阳性。

2.2 各猪场不同日龄猪的回肠炎感染情况

利用普通PCR对来自14家猪场的348份粪便样品进行了检测，133份样品为胞内劳森氏菌阳性，阳性率为38.22%。14家猪场的粪便样品都检出了胞内劳森氏菌，参检猪场的阳性率达到了100%。详细检测结果见表1。

从表1可以看出，不同猪场在猪群胞内劳森氏菌感染率上存在较大的差异，阳性率最大的为9号猪场，达到了73.33%，最低的是4号猪场，为10%。在5号猪场，未能从4～9周龄猪的粪便中检测到胞内劳森氏菌，随后逐渐检测到胞内劳森氏菌，说明存在感染情况，但整体阳性率不高，仅20%。不同猪场在生长育肥猪的阳性率高峰期上也有所不同，4～9周龄猪的阳性率为35.42%，11～20周龄猪的阳性率为37.5%，20周龄之后猪的阳性率为52%。1号猪场为一点式自繁自养猪场，生长猪群在4～9周龄时阳性率达到了50%，而母猪的阳性率为41.67%；2号猪场的母猪阳性率也达到了40%。这可能与不同猪场的管理水平和猪场药物干预的水平有关。

3 讨论

猪增生性肠炎对生长育肥阶段的猪影响明显，严重损害猪场的经济效益，且该病的发病率有逐渐上升的趋势。由于该病的死亡率不高，很多时候又不容易被人发现，因此未能引起广大养猪生产者的重视。本研究利用PCR技术检测了猪粪便中的胞内劳森氏菌，该方法特异性高，结果准确，可以反映出猪群胞内劳森氏菌实际感染情况，能够让各位猪场主客观认识和了解本场猪群的猪增生性肠炎的发病状况，及时采取科学的防治措施，提高猪场的经济效益，同时提高对猪增生性肠炎的重视程度。

本研究检测了14家猪场的348份猪粪便样品，阳性率达到了38.22%，其中参检猪场的阳性率为100%。可见，海南省部分地区的猪场普遍存在胞内劳森氏菌流行情况。国内也有学者对胞内劳森氏菌的流行情况进行了调查，如黄忠等[5]通过血清学方法对华南地区五省的猪场胞内劳森氏菌流行情况进行了分析，发现福建省和湖北省的猪场胞内劳森氏菌阳性率达90%。杨小燕等[6]应用PCR技术对胞内劳森氏菌在闽西地区猪场中的流行情况进行了调查，被检测的8家猪场的猪群均存在胞内劳森氏菌，其中6～8周龄猪的阳性率为46.7%，9～13周龄生长猪的阳性率为47.8%，14～20周龄猪的阳性率为42.9%。龙星等[3]对2009-2014年间的724猪粪便份样品进行了检测，共检测出阳性样品403份，阳性率55.66%，高于本研究的阳性率。不同年龄段的猪感染比例不一样，保育期前期的猪感染率为22.93%，而保育期后期的猪成活率能达到45.06%，生长期猪和育肥期猪的感染率分别达到69.15%和70.58%。

猪增生性回肠炎多发生于生长育肥阶段的猪，且各家猪场的疾病控制方案都不相同，导致了猪增生性回肠炎的发病率和发病时间都有差异，这为养猪生产中增生性回肠炎的防控制增加了难度。目前，我国科技人员对胞内劳森氏菌的流行情况调查主要采用血清学的方法，本研究利用PCR技术检测猪粪便样品，了解了海南省不同地区的猪的流行情况，为实际生产和猪增生性回肠炎的防控提供了科学依据。