抵当陷胸汤对糖尿病大鼠肝脏TGF-β1/Smad3信号通路的影响

蔡正银，储全根，轩 云，储 俊，王 盼

(1.安徽中医药大学中医学院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学科研实验中心，安徽 合肥 230038)

糖尿病肝损伤是糖尿病导致的病变之一，其病理改变包括炎症反应、脂质蓄积和肝脏纤维化等[1]，其中肝纤维化是该并发症的主要病变。高血糖导致肝纤维化的机制与糖基化终末产物(advanced glycosylation end products，AGEs)的形成及所诱导的一系列级联反应、氧化应激反应、相关细胞因子的作用、肝星状细胞的激活等均相关[2]。有实验[3]证明，在糖尿病模型大鼠病程8周时出现早期纤维化病理学的改变。TGF-β1信号传导通路激活在糖尿病肝损伤病变中具有重要作用。笔者认为，AGEs的形成、肝纤维化等病理变化与中医学“痰瘀阻络”病机相符，因而将具有“化瘀通络”作用的抵当汤与具有“化痰”作用的小陷胸汤合方(简称抵当陷胸汤)，以TGF-β1/Smad3信号通路相关蛋白和mRNA表达水平等作为观察指标，并以AGEs及其交联特异性蛋白抑制剂阿拉氯胺(alagebrium chloride-711，ALT-711)作为对照[4]，探讨抵当陷胸汤调控TGF-β1/Smad3信号通路的传导，从而干预糖尿病肝脏纤维化病变的部分机制。

1 材料

1.1 动物 选取健康雄性清洁级SD大鼠34只，体质量为(220±20)g、鼠龄为12周，由安徽医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK-(皖)2017-0001。实验获安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准，批文号为AHUCM-rats-2019014。

1.2 药物 抵当陷胸汤：全瓜蒌30 g，桃仁15 g，水蛭、虻虫、制大黄、清半夏各10 g，黄连5 g；由安徽中医药大学国医堂门诊部提供，煎煮浓缩制备成冻干粉。ALT-711，每支50 mg，MedChemExpress USA公司，批号 HY-106024B。

1.3 试剂 链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(S17049)：Sigma公司；Revert AidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit(00691399)：Thermo Scientific；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus(0512841)：Novoprotein；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG(137699，136080)：Zs-BIO。

1.4 仪器 高速台式冷冻离心机(JW-3021HR)：安徽嘉文；水平摇床(TS-1000)：海门市其林贝尔；自动曝光仪(JS-1070P)：上海培清；荧光定量PCR仪(PIKOREAL 96)：Thermo Scientific。

2 方法

2.1 动物分组、模型建立和干预方法 将34只SD大鼠适应性喂养1周，随机分成空白组10只，其余24只大鼠按55 mg/kg剂量腹腔注入STZ溶液，72 h后，尾静脉法测空腹血糖>16.7 mmol/L者即糖尿病模型复制成功[5]。将模型复制成功的大鼠随机分为模型组、抵当陷胸汤组和ALT-711组，每组8只。按人鼠体质量换算系数[6]换算后，空白组和模型组按等容积蒸馏水灌胃2 mL；抵当陷胸汤组按每日8.10 g/kg剂量灌胃抵当陷胸汤药液；ALT-711组按每日3 mg/kg剂量灌胃。第8周末用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)溶液腹腔注射麻醉状态下取材。

2.2 Western blot法检测TGF-β1、Smad3和p-Smad3的蛋白表达水平 每组取肝脏组织100 mg，加入细胞裂解液1 mL，离心后取上清液测总蛋白浓度；经10% SDS-PAGE电泳进行分离，将分离蛋白转移到PVDF膜上，转膜结束后用5%脱脂奶粉室温封闭2 h；根据一抗的说明书,TGF-β1、Smad3和p-Smad3抗体属性为兔抗1∶1 000稀释，4 ℃过夜，取出PVDF膜，加PBST洗涤液洗3次；根据二抗的说明书，按照1∶10 000用二抗稀释液稀释，室温孵育2 h；使用ECL发光试剂盒检测TGF-β1、Smad3和p-Smad3的蛋白表达水平。

2.3 实时荧光定量PCR法检测TGF-β1和Smad3 mRNA表达水平 每组取肝脏组织100 mg，液氮研磨成粉末，裂解冰浴后，提取RNA并测量其浓度和纯度；每组取质量为1 μg RNA逆转录成cDNA，其余样品-80 ℃冷冻保存备用。按照荧光定量PCR说明书，以β-actin为内参，设计引物序列。β-actin：上游CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游5′- TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，扩增片段长度为150 bp；TGF-β1：上游5′- AGGTCCTTGCCCTCTACAAC-3′，下游5′-CGTAGTAGACGATGGGCAGT-3′，扩增片段长度为96 bp；Smad3：上游5′- GAGTGGAGAGCAGGGACTTT-3′，下游5′- ACACACTCTCAGGTCAGTGG-3′，扩增片段长度为74 bp。PCR反应条件：预变性温度95 ℃，时间1 min；变性温度为95 ℃，时间20 s，退火温度为60 ℃，时间60 s，40个循环。

3 结果

3.1 各组大鼠肝脏组织TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白表达水平比较 与空白组比较，模型组大鼠肝组织TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白表达水平均明显上调(P<0.05)；抵当陷胸汤组和ALT-711组大鼠TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白表达水平较模型组均明显下调(P<0.05)，抵当陷胸汤组和ALT-711组TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，说明其效果相当。见图1、图2。

注：A.空白组；B.模型组；C.抵当陷胸汤组；D.ALT-711组

注：A.空白组；B.模型组；C.抵当陷胸汤组；D.ALT-711组； 与空白组比较，*P<0.05，与模型组比较，#P<0.05

3.2 各组大鼠肝脏组织TGF-β1、Smad3 mRNA表达水平比较 与空白组比较，模型组大鼠肝脏组织TGF-β1、Smad3 mRNA表达水平均明显上调(P<0.05)；抵当陷胸汤组和ALT-711组大鼠肝脏组织TGF-β1、Smad3 mRNA表达水平较模型组均明显下调(P<0.05)；抵当陷胸汤组和ALT-711组TGF-β1、Smad3 mRNA表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，说明其效果相当。见图3。

注：A.空白组；B.模型组；C.抵当陷胸汤组；D.ALT-711组；与空白组比较，*P<0.05，与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

目前的研究表明，TGF-β1是与肝脏纤维化密切相关的细胞因子。糖尿病患者长期在高血糖环境下，AGEs过度蓄积，在肝脏组织引起氧化应激反应及炎症反应，从而损伤肝细胞。肝脏受损伤时会分泌大量的TGF-β1，TGF-β1通过激活下游Smad3途径信号蛋白，作为共同递质和磷酸化的受体Smad3相结合形成低聚体复合物后在细胞核内进行转录[7]，实现对靶基因的调控，同时使肝星状细胞活化、增殖、转型并分泌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，ECM过度累积导致肝纤维化的发生。因此TGF-β1在纤维化起始和持续发展过程中起着关键作用，被认为是肝脏纤维化的潜在治疗靶标。

中医理论认为，作为代谢产物的AGEs具有“痰”的特点，而纤维化病变具有“络脉瘀阻”的特征，因此，可将AGEs蓄积及所导致的相关病变归之为痰瘀互结，采用痰瘀同治法。抵当陷胸汤具有“搜剔络道痰瘀同治”之功，小陷胸汤化痰，抵当汤化瘀通络，清除阻滞于络脉之病理废物，改善局部气血运行。抵当汤中水蛭咸苦平，虻虫苦而微寒，二药均有破血逐瘀通络之功；桃仁苦平，可活血祛瘀；大黄苦寒，既能泻热，也有化瘀作用；四药配伍，具有“搜络化瘀”功效。小陷胸汤中瓜蒌甘寒，可宽胸化痰；半夏辛温，化痰散结；黄连苦寒，泻热解毒；三药同用，可起“化痰清热”之效。综合以上药物，本方总体药性偏寒，既着眼局部病变，又兼顾糖尿病内热之基本病机。

课题组前期采用化瘀通络治法干预糖尿病心肌病变，已取得较好效果[8-9]。方朝晖亦认为运用活血化瘀是治疗糖尿病及其并发症的重要治则[10]。鉴于糖尿病肝损伤的纤维化病变与糖尿病心肌病变具有共同的病理改变，所以在前述研究基础上将化痰化瘀通络之法拓展到干预糖尿病肝脏病变。本实验结果表明，模型组的糖尿病大鼠TGF-β1/Smad3通路的相关蛋白和mRNA表达上调，而采用痰瘀同治的抵当陷胸汤后，TGF-β1/Smad3通路的相关蛋白和mRNA表达下调，与ALT-711组治疗效果相当，表明上述治法对糖尿病肝脏并发症肝脏组织TGF-β1/Smad3信号传导有抑制作用，与其他研究者[11-13]研究结果一致，因此可以认为，具有痰瘀同治的抵当陷胸汤可以通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路激活，从而对糖尿病大鼠的肝纤维化病变具有干预作用。