对一种黑木耳菌包厂发生的病害病原菌的鉴定

刘佳宁，马银鹏，张丕奇，马庆芳

(黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010)

0 引 言

黑木耳(Auriculariaheimuer)[1]是中国珍贵的食药兼用真菌[2]。目前，黑木耳已成为我国栽培产量仅次于香菇的第二大食用菌品种[3]。

近年来，随着我国食用菌产业的不断壮大和高速发展，黑木耳的栽培模式也从单门独户的小作坊式生产逐渐发展到工厂化生产，我国各地的菌包生产企业从无到有逐渐发展壮大。工厂化生产出的黑木耳菌包具有生产速度快，大小、质量规格统一，菌丝培养条件和时间相近，出耳芽较齐整的特点。由于工厂内存在大量的木屑、麦麸等原材料，生产环节和环境条件又极利于杂菌生长，因此黑木耳菌包生产厂的病害防治工作就显得极为重要，一旦爆发大规模病害将造成不可估量的损失。本研究从龙江县及其周边的多个黑木耳菌包生产厂采集病原菌样品，根据科赫法则的基本步骤进行了一系列分离培养、病原菌回接和形态及分子生物学鉴定等试验，确定了该病原菌的分类地位，为后续防治工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病害调查与病原菌菌株获取

采集具有典型病害特征的样品进行分离培养，获取纯病原菌菌株。该病害的典型特征为：病原菌在黑木耳菌袋内生长，萌发初期菌丝为白色或淡黄色，3～4 d后病原菌的菌落呈淡黄色或黄色。随着病原菌菌落的不断生长，菌落边缘的菌丝快速生长，初期呈白色后期呈淡黄色，当病原菌全部长满菌袋时，菌袋呈黄色。这种病害发生以后，剖开被感染的菌袋可发现，黑木耳菌丝生长缓慢，菌袋内的培养基几乎都被病原菌占据，造成黑木耳菌丝没有可利用的培养基而无法生长，如图1所示。

1.2 实验室复制病害典型特征

在黑龙江省龙江县黑木耳菌袋生产厂场采集具有明显病症的标本，经分离纯化后获得纯菌落，命名为未知病原菌(Unknown pathogen)。

根据科赫式法则，将分离出的病原菌与黑木耳进行回接试验(试验所用木耳菌为 “黑威29”，由黑龙江省科学院微生物研究所提供)，定期观察，记录发病情况。经过2周的培养后，黑木耳菌袋内出现了与病原地所采集样品同样的发病特征。

1.3 培养基配方

其一，改良PDA培养基。配方为：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1 000 mL、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5 g。

其二，菌袋培养基配方：木屑78%、麦麸20%、石膏1%、石灰1%。

其三，查氏酵母膏琼脂培养基(CYA培养基)配方：酵母粉5.0 g、蔗糖 30.0 g、NaNO33.0 g、K2HPO41.0 g、KCl 0.5g、MgSO47H2O 0.5 g、FeSO47H2O 0.01 g、琼脂15.0 g、蒸馏水 1.0 L。

图1 不同生长时期的黑木耳病原菌菌袋Fig.1 Bags of pathogens of Auricularia auricula at different growth stages

1.4 形态鉴定

用接种针将菌袋内的病原菌菌丝挑入改良PDA培养基平板中央，置于25℃恒温箱中培养，获得纯菌落。间隔24 h测量菌落直径，观察外观形态变化及颜色等，直至菌落长满平板为止，记录相关数据。用接种针挑取适量培养基、菌丝及其产物，置于载玻片的无菌水中，盖好盖玻片后直接在显微镜下观察照相并测量。

1.5 菌丝体培养及DNA提取

将菌种活化后接种于液体PD培养基中，25℃静置培养3～5 d，收集菌丝，滤纸吸干后置于-20℃保存。采用CTAB 法提取DNA。DNA 提取物于-20℃冰箱贮藏备用。

1.6 ITS序列比对与分析

对未知病原菌(unknown pathogen)，进行ITS 序列的扩增，引物为ITS1-F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′、ITS4-：5′-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG-3′。引物由大连宝生物有限公司合成。PCR反应在Gene Amp PCR System 9700 PCR仪上进行扩增，20 μL的反应体系内各种成分反应体系见表1，扩增程序见表2。测序由上海生物工程有限公司完成。

表1 ITS序列扩增反应体系表Tab.1 ITS sequence amplification reaction system

表2 扩增程序设置表Tab.2 Amplification program setting

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

PDA培养基上生长迅速，25℃培养5 d菌落直径6.9～7.2 cm，菌丝白色，产孢结构灰绿色，反面无色，无渗出液产生，无可溶性色素产生。菌丝细，具隔，分生孢子梗顶端轮轴状分状，排列不规则，小梗稍膨大，分生孢子串生，椭圆形。

CYA培养基，25℃，培养7 d，菌落直径约5.6～6.8 cm，白色或中心带有暗黄色，短丝绒状，致密，扁平，薄，中心有短放射状褶皱，无渗出液，无可溶性色素，反面淡黄色。产孢结构扫帚状，分生孢子梗分枝较短。孢子囊在短分支顶部长出小梗，小梗弯曲，顶部细尖。分生孢子多数亚圆形和椭圆形，少数瓜子形，表面光滑。

图2 未知病原菌菌落在CYA培养基上的形态Fig.2 Morphology of unknown pathogen colonies on CYA medium

2.2 序列分析

2.2.1 ITS扩增结果及分析

测序结果显示，供试菌株ITS 序列为506 bp，如下：

菌株的ITS 序列已提交GenBank，接受号为HM383041。

2.2.2 ITS序列系统发育分析

用已经获得的未知病原菌ITS序列在GenBank中比对，与相似度最高的6个不同种建立进化树，6种序列名称及GenBank号见表3：

表3 相似度较高的7个种的ITS 序列名称及号码表Tab.3 Seven kinds of ITS sequence names and numbers with high similarity

图3 未知病原菌(unknown pathogen)与相似度较高的6个品种的系统发育树Fig.3 Phylogenetic trees of unknown pathogens and 6 varieties with high similarity

由图3可知，各分枝内菌株间的最大遗传距离较大。其中病原菌(unknown fungi)与已知种Byssochlamysspectabilis，GenBank编号KT824760.1的序列遗传距离差异为0.0000，经比对后，其相似度为99%。结合宏观经典分类学数据进一步确定，该病原菌为壮观丝衣霉(Byssochlamysspectabilis)。其生物学分类为：子囊菌门(Ascomycota)、不整囊菌纲(Plectomycetes)、散囊菌目(Eurotiales)、曲霉科(Aspergillaceae)、丝衣霉属(Byssochlamys)、壮观丝衣霉(Spectabilis)。

3 讨论

根据形态学及分子生物学方法鉴定，将病原菌确定为壮观丝衣霉，该真菌属于散囊菌目(又称曲霉目或不整囊菌目)。在散囊菌目中，青霉属、曲霉属、丝衣霉属内的多种真菌广泛存在于土壤空气和水等自然环境中，这些真菌在获得适合的生长条件下往往可以高速生长、繁殖。在为生产黑木耳的菌包中存在大量的营养，可以被这些真菌利用。菌包生产企业如果未能在灭菌、接菌或培养等环节严格杜绝病原菌入侵，将会为病原菌的集中爆发提供有利条件，且在下一阶段的栽培环节中，在高温、高湿且栽培大棚通风较差的情况下，病原菌也极易生长，造成病害的大规模发生。由于黑木耳本身的生长、生殖所需要的营养、温度、湿度、pH、水分等基础条件与病原菌所需条件有巨大的交集，该病原菌由于生长速度极快，与黑木耳形成竞争关系，两种真菌共同利用培养基内的营养物质，因此对该病害的防治造成较大困难，希望通过后续研究能够找到应对该病害的合理措施。