蜂毒素靶向PTEN/PI3K/Akt 信号通路调控非小细胞肺癌细胞的增殖、凋亡

李玲霞，张英民

（河南科技大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，河南 洛阳 471000）

肺癌是一类世界范围内常见的呼吸系统恶性肿瘤，其发病率和病死率在恶性肿瘤中都居于首位[1]。非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常见的一类肺癌类型，占肺癌总发病率的80%左右[2]。肺癌发病前期并无明显临床症状，因此往往确诊时已经是晚期。肿瘤细胞的异常增殖是肿瘤恶化的主要原因，而大部分肿瘤细胞的无限增殖能力是通过死亡逃逸获得的[3]，因此，寻找安全有效的靶点诱导细胞的凋亡，抑制细胞的增殖成了肿瘤研究的热点。

蜂毒是蜜蜂工蜂分泌的一种毒液，蜂毒素（Melittin，Mel）是从蜂毒中提取的一种小分子蛋白，具有抗菌、抗病毒及抗炎镇痛作用[4]，蜂毒素对多种肿瘤细胞有抑制作用，且作用靶点多样化，包括直接杀伤细胞、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制肿瘤细胞血管生成等方面[5-6]。本研究中，我们探讨了蜂毒素对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡的影响，并探讨了其可能存在的作用机制，为非小细胞肺癌的临床治疗寻找更安全、有效的治疗手段。

1 材料与方法

1.1 实验用细胞与试剂 人源性非小细胞肺癌系A549 购自中国科学院上海细胞库；蜂毒素购自上海吉尔公司；含双抗的RPMI1640 培养基、胎牛血清购自美国Hy Clone 公司，MTT 试剂盒、Annexin V FITC/PI试剂盒购自美国BD 公司；兔抗人PTEN、p-PI3K 多克隆抗体、鼠抗人p-Akt 单克隆抗体、鼠抗人GAPDH单克隆抗体均购自美国Santa Cruz 公司，p53、CytC 及内参序列由上海吉玛制药技术有限公司合成，Trizol 购自美国Invitrogen 公司，逆转录试剂盒购自美国Sigma公司。

1.2 细胞的复苏与传代 将冻存的A549 细胞复苏、重悬于含10%胎牛血清的DMEM 培养基中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞铺满培养瓶底部70%以上时，将细胞用胰蛋白酶消化、重悬，按1:3 比例进行传代培养，取传代后对数期细胞进行后续实验。

1.3 MTT 检测细胞增殖活性 取对数期细胞接种于96 孔板，调整细胞密度为每毫升1×106个，按照实验设计将细胞分为4 组，分别为对照组、Mel 低剂量组、Mel 中剂量组和Mel 高剂量组，依次向各组细胞内加入不同浓度的蜂毒素，调整最终浓度为0、1、2、4 mg/L，每个浓度组设置5 个复孔。将各组细胞分别培养24、48、72 h 后，加入20 μL 的MTT 试剂，培养箱中孵育4 h，离心，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）溶液150 μL，充分震荡至澄清无结晶，于紫外分光光度计480 nm 波长处测吸光度（OD 值），增殖抑制率（%）=（1-处理组OD/对照组OD 值）×100%。

1.4 Annexin V FITC/PI 联合流式细胞仪检测细胞凋亡 将对数期细胞接种至6 孔板，调整细胞密度为每毫升5×105个，每孔内加细胞悬液2 mL，按1.3 所示分组，继续培养48 h 后，胰蛋白酶消化细胞，预冷PBS 洗涤2 次，离心，将细胞重悬于200 μL Binding Buffer 中，加入5 μLAnnexin V-FITC 混匀，室温条件下避光反应15 min，继续加入300 μLBinding Buffer，上流式细胞仪前加入5 μLPI，之后1 h 内上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 Western Blot 检测细胞内PTEN、p-PI3K 和p-Akt蛋白表达 将对数期细胞接种至6 孔板，调整细胞密度为每毫升5×105个，每孔内加细胞悬液2 mL，按1.3所示分组，继续培养48 h 后，胰蛋白酶消化细胞，二喹啉甲酸（BCA）法进行蛋白定量，取30 μg 待测样本蛋白进行10% SDS-PAGE 电泳，转至硝酸纤维素膜上，加入封闭液摇床孵育2 h，加入稀释一抗（1:1 000），4 ℃摇床过夜，加入稀释二抗（1:5 000），常温孵育2 h，洗膜后暗室中曝光显影。以内参β-actin为对照，采用Quality One 分析条带灰度值，以目的蛋白灰度值与β-actin 比值表示蛋白相对表达量。

1.6 RT-PCR 检测细胞内p53 和CyclinD1 基因表达 将对数期细胞接种至6 孔板，调整细胞密度为每毫升5×105个，每孔内加细胞悬液2 mL，按1.3 所示分组，继续培养48 h 后，胰蛋白酶消化细胞，Trizol 提取总RNA，异丙醇处理后收集RNA 沉淀，75%乙醇洗涤，离心，弃上清液，DEPC 水溶解RNA。根据逆转录试剂盒说明，以β-actin 为内参进行PCR 扩增，反应条件：95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 个循环；72 ℃总延伸6 min。取5 μL PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，进行灰度扫描分析，比较目的基因与β-actin 条带灰度之比。引物序列：p53 上游引物：5’-TCGGATTCGGATCGATCGGC-3；下游引物：5’-GCTTAGCTTTCGATCGGATC-3’；CyclinD1 上游引物：5’-TAGCTTTGCTAGCCTACGAT-3；下游引物：5’-TAGCTATTGCTAGGGGCTTA-3’；GAPDH 上 游引物：5’-TAGCTTTAGCTAGGGCTTAG-3；下游引物：5’-TAGCTTTAGCTAGCTTTAGC-3’。

1.7 统计分析 用SPSS19.0 软件进行统计分析；计量资料以均数±标准差（）表示，多组计量资料间的比较用ANOVA检验，组内两两比较用LSD-t检验。

2 实验结果

2.1 蜂毒素对A546 细胞增殖活性的影响 MTT 实验结果显示，与对照组相比，各个时间点的蜂毒素处理组细胞的增值抑制率显著增加（P＜0.05），且抑制效果与药物浓度呈正相关；Melittin 低剂量组24 h 和48 h 间抑制率无显著性差异（P＞0.05），而72 h 抑制率显著高于24 h（P＜0.05），同时，中剂量和高剂量组的抑制效果随着培养时间的延长而增加，呈时间依赖性（P＜0.05）（见图1）。

图1 各组A549 细胞增殖抑制率

2.2 蜂毒素对A546 细胞凋亡的影响 蜂毒素作用组细胞凋亡率显著高于对照组（P＜0.05），且随着药物浓度的增加，凋亡率随之增加（P＜0.05），各药物浓度组间存在显著性差异（P＜0.05）（见图2）。

图2 各组细胞凋亡率

2.3 蜂毒素对A546 细胞PTEN、p-PI3K 和p-Akt 蛋白表达的影响 蜂毒素作用组细胞PTEN 的蛋白表达量显著高于对照组（P＜0.05），而p-PI3K 和p-Akt 蛋白表达量显著低于对照组（P＜0.05），同时，随着药物浓度的增加，蜂毒素对PTEN 表达的诱导作用和对p-PI3K 和p-Akt 的抑制作用随之增加，各药物剂量组之间存在显著性差异（P＜0.05）（见图3，表1）。

图3 各组细胞PTEN、p-PI3K 和p-Akt 蛋白表达

表1 各组细胞PTEN、p-PI3K和p-Akt蛋白表达（，n=5）

表1 各组细胞PTEN、p-PI3K和p-Akt蛋白表达（，n=5）

注：与对照组比较，# P ＜0.05；与Mel 低剂量组比较，△P ＜0.05；与Mel 中剂量组比较，▲P ＜0.05

2.4 蜂毒素对A546 细胞p53 和CyclinD1 mRNA 表达的影响 蜂毒素作用组细胞内p53 mRNA 的表达显著高于对照组（P＜0.05），随着药物浓度的增加，表达量递增（P＜0.05）；蜂毒素作用组细胞内CyclinD1 mRNA 的表达显著弱于对照组（P＜0.05），随着药物浓度的增加而递减（P＜0.05）（见表2）。

表2 各组细胞p53 和CyclinD1 mRNA 表达水平比较（，n=5）

表2 各组细胞p53 和CyclinD1 mRNA 表达水平比较（，n=5）

注：与对照组比较，# P ＜0.05；与Mel 低剂量组比较，△P ＜0.05；与Mel 中剂量组比较，▲P ＜0.05

3 讨论

蜂毒素是从蜂毒中提取出来的活性物质，具有多种生物学功能，其抗肿瘤作用已在多种肿瘤细胞中得到证实，蜂毒素能抑制多种肿瘤细胞的增殖，同时促进肿瘤细胞的凋亡[5-9]。本研究中，我们检测了不同浓度蜂毒素对非小细胞肺癌细胞A549 增殖、凋亡的影响，结果显示，低剂量蜂毒素即能有效抑制其增殖活性，这种作用随着药物浓度的增加和作用时间的延长而加强，同时，蜂毒素能显著促进A549 细胞的凋亡，这种抑制作用呈现剂量依赖性。以上实验结果表明，蜂毒素对非小细胞肺癌细胞有生长抑制作用，为了进一步了解蜂毒素对A549 细胞的作用机制，我们进一步探讨了其对A549 细胞中PTEN/PI3K/Akt 通路相关分子表达的影响。

人第10 号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物（Gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN）是目前已知的能抑制肿瘤活性的磷酸酶[10]，磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）/丝氨酸—苏氨酸激酶（Protein kinase B,Akt）信号通路在肿瘤细胞信号转导中起重要作用，其异常活能促进细胞增殖并抑制细胞的凋亡[11]。有研究证实，在肿瘤细胞中，PTEN 通过其脂质磷酸酶活性作用于PI3K/Akt 通路，阻断该通路活性从而发挥抑癌作用[12]。在肺癌细胞的一项研究中发现，PI3K 抑制剂GSK2636771 能抑制PTEN 表达缺失的肺癌细胞株的增殖并促进细胞的凋亡，将载有PTEN 基因的质粒导入细胞后，PI3K 抑制剂对肺癌细胞增殖、凋亡的影响增强，说明该通路在肺癌细胞的增殖、凋亡过程中发挥重要作用[13]。有报道称，蜂毒素能上调HepG2 肝癌细胞中PTEN 并抑制下游Akt 通路的激活，从而促进肝癌细胞的凋亡，抑制其增殖[14]。基于以上理论，本研究中，我们探讨了蜂毒素对A549 细胞中PTEN/PI3K/Akt 通路中相关分子表达的影响，结果显示，蜂毒素能刺激A549 细胞中PTEN 的表达，同时抑制PI3K 和Akt的磷酸化，且这种作用随着药物剂量的增加而加强，说明蜂毒素能有效调控A549 细胞内PTEN/PI3K/Akt 通路的活性。

为了进一步探讨蜂毒素对A549 细胞的作用机制，我们检测了蜂毒素对PTEN/PI3K/Akt 通路两个重要的下游因子的作用。p53 是PI3K/Akt 信号通路的一个下游抑癌基因，p53 被活化后能通过上调Caspase-3 和Caspase-9 而诱导细胞凋亡，PI3k/Akt 通路的活化能引起p53的降解，从而影响细胞凋亡[15]，同时有研究证实，p53 介导的肿瘤细胞凋亡在肺癌细胞的发生过程中发挥重要作用[16]。cyclinD1 是PI3K/Akt 通路的另一下游分子，其过表达时能导致细胞异常增殖，细胞周期发生异常变化，对肺癌细胞的增殖起到重要作用[17]。本研究中我们发现，蜂毒素能诱导A549 细胞中p53 蛋白的表达，而抑制cyclinD1 的表达，且这种作用呈剂量依赖性，说明蜂毒素可能时通过抑制PTEN/PI3K/Akt的活性，从而刺激p53 的表达，抑制cyclinD1 的表达而对A549 细胞发挥作用的。

综上所述，蜂毒素能抑制A549 细胞的增殖，促进其凋亡，这种作用可能是通过调控PTEN/PI3K/Akt信号通路相关分子的表达而实现的。