吴茱萸生物碱多指标优化提取新方法的探索

龚乃超，锁进猛，李梦婷，张浩，乐薇

（武汉工商学院环境与生物工程学院，湖北武汉430065）

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa（Juss.）Benth、石虎 Evodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang或疏毛吴茱萸 Evodia rutaecarpa（Juss.）的干燥近成熟果实。常用于治疗厥阴头痛、寒病腹痛、寒湿脚气、经行腹痛、院腹胀痛、呕吐吞酸、五更泄泻等，外治口疮，高血压症[1]。药理研究表明，生物碱类和苦味素类是吴茱萸的主要活性成分[2-4]，目前吴茱萸碱与次碱提取的方法有炮制法[5]、回流法、索氏提取法、超声波提取法[6-9]、微波提取技术[10-12]、超临界流体萃取[13]等方法。传统的溶剂提取法存在能耗高、周期长、工序多、收率低、劳动强度大，高温破坏热敏性成分等不足。随着工业化生产规模的扩大，传统提取技术的种种缺陷，越来越制约了人们对中药资源的开发利用。内部沸腾法是韦藤幼等[14]提出的一种强化提取过程的新方法，具有提取温度低、速度快、操作简单的特点，对提取热敏性物质更具有优势，在中药提取和天然化学成分研究等方面具有广泛的应用前景[15]，将为中药研究开辟一个新的途径以及中药复方的提取工艺研究带来极大的便利，但将其应用于中药方剂的提取仅刚刚开始，创新研究的空间和前景很大。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

吴茱萸：江西省宜春市国苑中药材有限公司；吴茱萸碱、吴茱萸次碱（标准品/100801001）：天津一方科技有限公司。

1.2 仪器与设备

KQ-50E型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；SP752型紫外分光光度器：北京君意东方电泳设备有限公司；5810R型高速冷冻离心机：德国艾本德仪器有限公司；RE52CS旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；AUY120电子天平：日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 双波长分光光度法测定吴茱萸碱与次碱的含量

基于文献[16-19]报道的双波长分光光度法的测定原理，提出了利用双波长法同时测定吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法，该法首先测定提取液溶液在224、344 nm处的吸光度值，利用联合方程同时求解出吴茱萸碱与次碱浓度。

联合方程如下：

按照上式计算得出吴茱萸碱与次碱浓度，代入下式计算得率：

式中：c为吴茱萸碱或次碱浓度的浓度，（μg/mL）；m为吴茱萸粉末的质量，g；V为定容的体积，mL；n为稀释倍数；δ 为质量转换单位，（δ=1.0×106）。

1.3.2 超声联合减压内部沸腾法

1）采取少量乙醇溶液润湿吴茱萸粉末于30℃下超声波一段时间，以使吴茱萸碱与次碱与能被充分解吸。

2）解吸后再取一定量30℃的水，将其置于精密恒温水浴槽中，并迅速减压到某一压力下，使物料内部有少量气泡连续冒出，提取一段时间。

1.3.3 正交试验设计

选取解吸剂用量（A）、解吸时间（B）、操作压力（C）与减压时间（D）进行L9（34）正交试验设计，因素水平设计见表1。

表1 正交试验因素表Table 1 Factors orthogonal test table

1.3.4 其他方法提取吴茱萸碱与次碱

采用其他提取方法分别对吴茱萸碱与次碱进行提取，并利用双波长分光光度法测定提取液中的吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量。以吴茱萸碱与次碱得率为考察指标，将本法与传统热炮制提取法、超声提取法、微波提取法相比较。

2 结果与分析

2.1 紫外吸收光谱分析

吴茱萸碱和吴茱萸次碱标准品的紫外吸收光谱如图1所示。

图1 吴茱萸碱与吴茱萸次碱标准品的UV光谱图Fig.1 Evodiamine and rutecarpine standard ultraviolet-visible spectra

由图1可知，吴茱萸碱在224 nm处有最强吸收峰，吴茱萸次碱标准品在215 nm和344 nm有最强吸收峰，215 nm处为二氢吲哚碱类的紫外吸收带[19]，因此，在进行双波长分光光度法测定吴茱萸碱与次碱含量时，选择224 nm与344 nm。

2.2 吴茱萸碱与次碱标准曲线的制作

精密称取吴茱萸碱和次碱对照品2.5 mg，用无水乙醇配成50 μg/mL的吴茱萸碱母液。分别准确量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 吴茱萸碱母液，用无水乙醇定容于50 mL容量瓶。分别在吴茱萸碱和次碱最大吸收波长下测吸光度。以浓度为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制吴茱萸碱和次碱的标准曲线，见图2。

图2 吴茱萸碱、次碱含量测定标准曲线Fig.2 Evodiamine and rutecarpine content determination of standard curve

2.3 超声解吸过程对吴茱萸碱与次碱提取得率的影响

2.3.1 解吸剂浓度对吴茱萸碱与次碱提取得率的影响

准确称取吴茱萸1.00g，按照1.3.2方法提取吴茱萸碱与次碱，并测其得率（下同），解吸剂浓度对吴茱萸碱与次碱得率的影响如图3所示。

由图3可知，随着乙醇浓度的增加，吴茱萸碱与次碱的得率也随之增加，80%的乙醇对植物细胞具有最大的渗透和解吸能力，所以本试验选择80%的乙醇作为最佳解吸剂浓度。

图3 解吸剂浓度对吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取率的影响Fig.3 Fesorption agent concentration of evodiamine and rutecarpine extraction yield

2.3.2 解吸剂用量对吴茱萸碱与次碱提取得率的影响

解吸剂用量对吴茱萸碱与次碱得率的影响如图4所示。

图4 解吸剂用量对吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取率的影响Fig.4 Desorption agent of evodiamine and rutecarpine extraction yield

由图4可知，随着解吸剂用量的增多，吴茱萸碱与次碱提取得率也随之增加，当解吸剂用量增加到5 mL/g时，提取得率基本已趋于平缓。这是由于解吸剂用量太少时，乙醇解吸植物细胞不够充分，提取活性成分少，当解吸剂用量已足够润湿物料，解吸基本达到饱和时，如再继续增加解吸剂用量是不经济的，所以本试验选择5 mL/g作为解吸剂用量。

2.3.3 解吸时间对吴茱萸碱与次碱提取得率的影响

超声解吸时间对吴茱萸碱与次碱得率的影响如图5所示。

由图5可知，随着超声解吸时间的增多，吴茱萸碱与次碱提取得率也增加，当超声解吸时间增加到20 min时，提取得率达到最大。当超声解吸时间20 min时，提取率下降。随着超声解吸时间的延长，超声波的作用也相应加强，吴茱萸碱与次碱浸出量增加，但超声波的空化作用也能使其他物质浸出，提取过程中吴茱萸碱与次碱和其他物质发生竞争，所以提取时间大于20 min时吴茱萸碱与吴茱萸次碱的提取率下降，所以本试验选择20 min作为超声解吸剂时间。

图5 超声解吸时间对吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取率的影响Fig.5 Ultrasonic desorption time of evodiamine and rutecarpine extraction yield

2.4 减压提取过程对吴茱萸碱与次碱提取得率的影响

2.4.1 操作压力对吴茱萸碱与次碱提取得率的影响

操作压力对吴茱萸碱与次碱得率的影响如图6所示。

图6 操作压力对吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取率的影响Fig.6 Operating pressure of evodiamine and rutecarpine extraction yield

由图6可以看出，操作压力过低时渗透到内部的乙醇达不到沸腾的要求，而压力过高时沸腾汽化剧烈，因此压力过低或过高都不适合吴茱萸碱与次碱的提取，当操作压力为0.04 MPa（绝对压力）为最适提取条件。这主要是由于解吸过程中，渗透到植物细胞内部的乙醇，在该提取压力下沸腾效果最好，持续时间最长。所以本试验选择0.04 MPa作为减压操作的工作压力。

2.4.2 减压时间对吴茱萸碱与次碱提取得率的影响

减压时间对吴茱萸碱与次碱得率的影响如图7所示。

由图7可知，随着减压时间的增加，吴茱萸碱与次碱的提取得率在逐渐增大，在5 min时达到最高，之后随着提取时间的延长，吴茱萸碱与次碱的提取得率呈现下降的趋势。可能是时间过长，引起乙醇沸腾汽化剧烈进而使吴茱萸碱与次碱的提取得率降低，所以本试验选择5 min作为减压操作的工作时间。

图7 减压时间对吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取率的影响Fig.7 Decompression time of evodiamine and the influence of rutecarpine extraction yield

2.5 正交试验对吴茱萸碱与次碱提取得率的影响

2.5.1 吴茱萸碱与次碱提取条件的确定

在单因素试验的基础上，为进一步研究解吸剂用量（A）、解吸时间（B）、操作压力（C）与减压时间（D）4个因素对吴茱萸碱与次碱提取得率的影响进行考察，以确定超声波联合减压-内部沸腾法最佳提取工艺条件。本试验采用L9（34）正交试验，以吴茱萸碱与次碱提取得率为指标进行正交优化试验，试验结果如表2所示。

表2 吴茱萸碱与次碱正交试验方案及极差分析结果Table 2 Evodiamine and rutecarpine orthogonal test and extreme difference analysis results

由表2中极差R来看，正交试验所考察的4个因素对吴茱萸碱与次碱提取得率的影响基本一致，各因素对吴茱萸碱提取得率的影响较显著，4个因素对吴茱萸碱得率的影响程度为B＞A＞D＞C，即解吸时间＞解吸剂用量＞减压时间＞操作压力，最佳的提取工艺为A3B2C1D3，即在解吸剂用量 6 mL、解吸时间 20 min、操作压力0.03 MPa、减压时间6 min时吴茱萸碱与次碱提取得率最高。

2.5.2 正交试验方差分析

取各列偏差平方和中最小的近似当作误差的估计，选用因素C操作压力为误差估计，方差分析结果见表3与表4。

表3 吴茱萸碱正交试验方差分析结果Table 3 Evodiamine orthogonal test the result of variance analysis

表4 吴茱萸次碱正交试验方差分析结果Table 4 Rutecarpine orthogonal test the results of variance analysis

由方差分析结果可知，因素A、B、D，即解吸剂用量、解吸时间、减压时间对吴茱萸碱提取得率的影响要大于对吴茱萸次碱提取得率的影响，且解吸剂用量、解吸时间对结果影响较为显著，与极差分析结果基本一致。

2.5.3 验证试验

在正交试验结果最佳工艺条件下，即解吸剂用量6 mL、解吸时间20 min、操作压力0.03 MPa、减压时间6 min条件下时，吴茱萸碱与次碱的提取率最大，并与传统炮制提取法、超声波提取法及微波提取法相比较，结果见表5。

表5 验证试验与其他最佳提取方法Table 5 Validation testing and other best extraction method

结果显示超声联合减压内部沸腾法提取得率明显高于传统炮制提取法、超声波提取法及微波提取法，超声联合减压内部沸腾法提取时间缩短1/2、乙醇溶剂用量减少80%，反应条件温和，提取过程危险性大大降低。

3 结论

超声联合内部沸腾法提取中药吴茱萸在解吸剂用量6 mL、解吸时间20 min、操作压力0.03 MPa、减压时间6 min的条件下，吴茱萸碱的得率为2.54%，吴茱萸次碱的得率为0.87%。与炮制提取法0.72%、0.34%，超声波提取法1.29%、0.52%，微波提取法0.92%、0.37%相比超声联合内部沸腾法提取温度低、速度快、溶剂消耗量少，大大提高了提取生产过程的安全性，所得提取液质量高。超声联合内部沸腾法用于提取吴茱萸生物碱优势明显。综上所述，超声联合内部沸腾法提取为吴茱萸药材的较佳提取方法。