同种异体牙囊细胞膜片在异种生物牙根再生中作用

韩雪 郭维华

本课题组前期已经成功利用同种异体的处理后牙本质基质(allogeneic treated dentin matrix，aTDM)作为生物支架复合同种异体牙囊细胞(allogeneic dental follicle cell, aDFCs)或牙囊细胞膜片(allogeneic dental follicle cell sheets, aDFCSs)构建同种异体的生物牙根，并在大小动物体成功再生出类似牙髓-牙本质复合体及牙周-牙本质复合体的结构[1-2]。猪来源的组织器官与人体组织器官具有相似的大小及物理化学结构，已被应用于修复多种组织/器官损伤或缺损，成功解决了同种异体器官来源短缺问题[3]。本课题组通过同种异体的细胞悬液接种至异种的处理后牙本质基质(xenogeneic treated dentin matrix，xTDM)支架的方式构建的异种生物牙根，在体内成功再生出类似于天然牙根的生物牙根复合体[4]。然而在异种支架植入后期出现了明显的免疫炎症反应，表现为生物支架的溶解、吸收、排出，导致植入失败。

研究表明，异种脱细胞支架材料引起的免疫排斥反应主要表现为慢性炎症[5]。移植物植入宿主后，来自血液和组织间液的蛋白质立即吸附到生物材料表面形成蛋白层，此层决定了凝血级联反应、补体系统、血小板及免疫细胞激活并引导他们相互作用，标志炎症反应的开始[6]。因此有研究将异种来源的移植物包裹于有隔离作用的膜内，实现免疫隔离，进而促进移植的成功[7]。随着细胞膜片技术的成熟，将种子细胞以膜片的方式与支架材料复合更简单有效，同时膜片含有相对较少的细胞及丰富的细胞外基质，其免疫源性进一步降低。因此本实验拟运用aDFCSs复合xTDM构建异种生物牙根，以探究aDFCSs是否能够降低免疫排斥反应促进异种生物牙根再生，以期进一步优化生物牙根的构建策略。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

α-型改良伊格尔培养基(α-MEM，Hyclone，美国)； 胎牛血清(FBS, Gibco，美国)； 双抗溶液(Invitrogen，美国)； I型胶原酶(collagenase type I)、 L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)、 茜素红、 EDTA(Sigma，美国)。

1.2 猪来源TDM的制备

选用12～15 月龄的小型猪的新鲜下颌切牙制备TDM。使用牙科用高速涡轮机去除牙冠及牙根表面覆盖的牙周组织及牙骨质。使用拔髓针完整拔除牙髓组织，并用高速涡轮机磨除残余牙髓组织及前期牙本质。进一步加工成长约 10 mm，直径 3～5 mm 的标准形态用于体外实验；长×宽为2 mm×2 mm方形的片段用于大鼠颌骨内移植。依据以往实验方法，在含有不同浓度的乙二胺四乙酸(EDTA)中进行梯度脱矿，每个浓度梯度脱矿30 min制备成xTDM。

1.3 牙囊细胞的提取及多向分化检测

人源性的DFCs来自因临床原因拔除的第三阻生牙的牙囊组织，鼠源性的DFCs来自于出生2～3 d的乳鼠磨牙的牙囊组织。通过I型胶原酶提取牙囊组织中的牙囊细胞，并通过连续传代纯化。采用第3 代的DFCs用于后续实验。通过茜素红染色、油红O染色及免疫荧光检测神经细胞表面标记βШ-tubulin，检测牙囊细胞的多向分化潜能。

1.4 牙囊膜片的培养

将生长状态良好的第3 代牙囊细胞按2×105/孔接种至6 孔板内，待细胞密度达到70%时，更换成含有50 μg/ml抗坏血酸的细胞膜片培养基。每3 d更换培养基，连续培养直至形成肉眼可见的细胞膜片。

1.5 异种生物牙根的构建

将膜片剥离孔板底部，用钝性眼科镊将小心膜片均匀的包裹在1.2中制备好的TDM上，于正常培养基中培养用于体内或体外实验。

1.6 生物牙根复合体中牙囊细胞活死细胞检测

LIVE/DEAD Cell image Kit试剂盒来染色检测生物牙根构建后及培养1 d后细胞膜片内细胞存活情况，于染色后2 h内于激光共聚焦显微镜(Olympus，日本)下采集3D图像。

1.7 实时荧光定量PCR

以 1×105个细胞/孔的细胞密度接种于6 孔板中，待细胞贴壁后加入TDM与人源性的DFCs共培养3 d，以未加入TDM牙囊细胞作为阴性对照组。提取mRNA并进行逆转录。以 GAPDH为内参，采用real-time PCR(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，Thermo Scientific，MA, USA)检测IL-6及TGF-β免疫相关基因的表达。相关引物序列见表 1。

表 1 实时荧光定量PCR引物

1.8 异种生物牙根大鼠颌骨内移植

取10 周龄的SD大鼠8 只，随机分成2 组，每组4 只大鼠。 实验组植入异种生物根，对照组植入TDM。于下颌角至磨牙后区中间采用种植机预备直径3 mm，深1 mm大小的植入洞型。分别植入异种生物牙根和TDM，严密缝合伤口，分别于1 周和4 周取材。通过HE和Masson染色观察组织再生情况，通过Trap染色观察免疫排斥情况。

1.9 数据统计及分析

2 结 果

2.1 牙囊细胞多向分化潜能

经茜素红染色，镜下可见钙化结节样结构(图 1A)。成脂诱导诱导后经油红O染色，胞浆内可见大小不等的脂滴分布(图 1B)。成神经诱导培养后，分化后的DFCs阳性表达神经细胞表面标记βШ-tubulin(图 1C)。以上结果说明，经过分离培养DFCs具有多向分化潜能。

2.2 生物牙根复合体中牙囊细胞活死细胞检测

生物牙根复合后即刻活死细胞检测结果显示，仅于膜片边缘检测到少量红色的死细胞(红色)，机械损伤及环境突变均未对牙囊细胞活性造成显著的影响。培养1 d后，膜片中牙囊细胞活性良好，异种生物材料对膜片中牙囊细胞无细胞毒性。

A: 茜素红染色(×40)； B：油红O染色(×200)； C：βⅢ-tubulin免疫荧光检测(×400)

图 2 牙囊细胞膜片活(绿色)死(红色)细胞染色(×100)

Fig 2 Live (green)/ dead (red) cell staining of aDFCSs(×100)

2.3 牙囊细胞分化过程中免疫相关因子检测

Real-time PCR结果显示，与对照组相比，xTDM组牙囊细胞IL-6基因表达显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。TGF-β表达稍降低，差异具有统计学意义(P<0.01)(图 3)。

图 3 各组aDFCs细胞因子基因表达分析

2.4 异种生物牙根体内移植后TRAP阳性破骨细胞变化

植入1 周后，xTDM组可见大量的破骨细胞聚集在TDM表面及颌骨表面。生物牙根组TDM为纤维组织包绕，未见TRAP阳性破骨细胞。 植入4 周后，xTDM组生物支架吸收明显，但TRAP阳性破骨细胞消失。生物牙根组部分TDM区域可见破骨细胞，并形成吸收陷窝。

2.5 异种生物牙根体内移植后组织再生

HE与Masson结果显示植入4 周后，xTDM组骨质增生矿化明显且处于矿化成熟阶段。生物牙根组TDM周围形成排列有序的纤维结构，并分离生物牙根与骨组织。靠近TDM侧的细胞成高柱状，类似成牙本质细胞(图 5)。

图 4 大鼠颌骨内异种生物牙根移植后TRAP染色(×200)

Fig 4 TRAP staining of xenogeneic bio-root after implantation in rat mandible(×200)

图 5 异种生物牙根移植后4 周组织学染色(×200)

Fig 5 Histologic staining of xenogeneic bio-root 4 weeks after implantation(×200)

3 讨 论

随着生物材料、干细胞生物学及临床医学的不断发展，组织工程技术已发展成为解决可移植组织与器官的短缺的有效手段。异种生物支架因其材料来源丰富，经脱细胞处理后免疫源性大幅降低，已成为组织工程学界研究的热点[8]。细胞膜片是由相对较少的细胞及较丰富的细胞外基质形成的内源性支架，具有多种蛋白和蛋白多糖[9]。与传统组织工程中采用细胞悬液复合生物支架的方式相比，将种子细胞以膜片的方式与支架相复合的方式细胞浪费率更低、分布更均匀、操作简单、接种效率高而越来越受到重视。本实验尝试将aDFCSs与猪来源的TDM相复合构建异种生物牙根，植入大鼠颌骨内观察同种异体牙囊细胞膜片在异种生物牙根再生中的作用。

组织工程化生物牙根构建中，膜片技术能延长种子细胞的生存时间，并能够释放多种细胞因子以促进组织再生[10]。但是随着膜片培养时间的延长，其中间部分的细胞会因营养不足而发生凋亡，同时复合支架的机械操作也对膜片中细胞造成损伤。凋亡细胞会激活机体免疫清除功能，导致组织损伤[11]。实验结果表明培养3 周的细胞膜片内牙囊细胞活性良好，复合操作对牙囊细胞损伤较小。因此采用此方法构建生物牙根合理可行。

生物牙根植入体内4 周后，生物牙根周围形成了排列有序的类牙周膜-牙本质的纤维结构。研究表明DFCSs表达多种成牙/成骨相关蛋白如DMP-1、COL-1、ALP、OCN等，有助于纤维组织及牙体组织再生[12]。牙囊细胞膜片结构致密，起到类似于牙周组织再生中GTR膜作用，分隔牙和骨从而降低粘连发生的机率，有利于牙周膜复合体的形成。

而未包裹牙囊细胞膜片的xTDM支架植入大鼠颌骨内后，靠近颊侧以骨增生为主，靠近口腔侧以吸收为主。破骨细胞早期识别脱细胞支架中残留的损伤相关分子模式蛋白(DAMPs)，上调核心结合因子NF-κB的受体(RANKL)造成支架吸收[13]。基于破骨细胞/成骨细胞平衡，于支架另一侧形成新生骨[14]。

研究表明间充质干细胞不仅具有多向分化潜能而且能够在组织再生中发挥免疫调控作用。例如：刘文静等研究发现，在炎症环境中，人颞下颌关节滑液间充质干细胞分泌的IL-6和IL-8明显增加，并参与介导关节软骨破坏[15]。Marusina等[16]研究发现间充质细胞IL-6的分泌减少有助于伤口的愈合。本研究中牙囊细胞与异种生物支架相互作用后，IL-6的分泌显著减少，可能有利于生物牙根移植后的组织再生。经牙囊细胞膜片修饰后的xTDM对于机体免疫系统形成同种异体干细胞膜片植入物的假象，进而进一步降低免疫炎症反应，促进组织修复进程。

综上，同种异体牙囊细胞膜片异种生物牙根再生中不仅起到种子细胞的作用，同时作为屏障起到分隔组织发育区及阻挡免疫炎症反应进程的作用。

doi:10.1002/adhm.