保元汤对正常小鼠免疫力功能的影响

张 祎，陈桂芳，袁玲玲，丁丽娜，杨卫平，杨静雯，王睿睿,钱如贵

(1.云南中医药大学 中药学院,云南 昆明 650500；2.云南省民族特色养生理论与健康产品工程实验室,云南 昆明 650500；3.昆明邦宇制药有限公司,云南 昆明 650211)

保元汤为明代孙志宏所著《简明医彀》中记载的经典方剂，制法为“人参一钱，黄芪二钱，甘草五分，肉桂二分.右加生姜一片，水煎服”，可大补元气，主治元气虚弱之证[1].根据古代医药典籍记载的药方组成，可以将该方开发为增强免疫力功能的产品，符合来源于经典名方、治未病的现代健康理念，本文完成保元汤提取物对正常小鼠免疫力功能影响的实验研究，为以保元汤为基础配方的健康产品研究开发提供实验依据，也可为古代经典方剂的现代应用提供研究思路.

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级ICR小鼠，单一性别，体重18～22 g，购自昆明医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK(滇)K2015-0002.实验前在动物房环境中适应性饲养1周，饲养环境温度20～26 ℃(日温差≤3 ℃)，相对湿度40%～70%，换气次数10～20次/h，气流速度0.1～0.2 m/s，噪音≤60 dB，工作照度>300lx，动物照度15～20lx，12 h明暗交替照明，使用许可证：SYXK(滇)K2017-0005.

1.2 实验材料

刀豆蛋白A，Sigma，批号C6110；2,4二硝基氟苯，成都贝斯特试剂有限公司，批号20180607；青霉素链霉素混合液(100×，批号180625)、姬姆萨染色液(批号20181208)、印度墨水(批号20180730)、MTT(批号298-93-1 )，购自北京奥拓科技有限公司；PBS缓冲液(批号8118127)、RPMI 1640细胞培养液(批号8118314)，购自赛默飞世尔仪器有限公司；DM500普通光学显微镜，德国Leica；SpectraMax Plus384酶标仪，美国MD；5810R高速冷冻离心机，德国Eppendorf.

1.3 样品制备

参照文献[2]报告的配方和制备方法，制备200人份的药材处方为：人参300 g、黄芪600 g、肉桂 60 g、生姜300 g、甘草150 g，经水提取，提取物的成人推荐用量为1.75 g/d.

1.4 剂量设计与分组

受试物为1.3制备的提取物，每个试验项目均设立对照组和不同剂量的实验组，每组10～15只动物，其中，实验组分别设0.15、0.30、0.60 g/kg bw剂量组(为人体推荐用量的5、10、20倍)，受试物以纯化水配制，配制后2～8 ℃下保存不超过3 d，所有实验组经口灌胃给予不同剂量的受试样品，灌胃容积为20 mL/kg bw，每天1次，每周称量体重1次，并根据动物体重调整灌胃体积，对照组给予等体积的纯化水.

1.5 实验方法

参考文献[3-4]方法，采用小鼠碳粒廓清实验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验和NK细胞活性测定，观察保元汤提取物对正常小鼠非特异性免疫功能的影响；采用小鼠迟发型变态反应、血清溶血素生成实验、ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验，观察保元汤提取物对正常小鼠特异性细胞免疫和体液免疫的影响.

1.5.1 小鼠碳廓清实验

选用雌性小鼠60只，按体重随机分为4组，每组15只，连续给药30 d，末次给药后30 min，按 100 mL/kg 尾静脉注入10%印度墨汁，在注射后2、10 min时，小鼠眼眶静脉取血20 μL置于含2 mL 0.1%Na2CO3溶液的试管中混匀，酶标仪测定 600 nm 处吸光度，将动物处死，取其胸腺、脾器官称重，计算吞噬系数、胸腺系数和脾脏系数.

1.5.2 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞

选用雌性小鼠48只，随机分为4组，每组12只，连续给药30 d，在取材前4d给每只小鼠腹腔注射2%压积鸡血红细胞0.2 mL，取材时颈椎脱臼处死小鼠，每只腹腔注射含胎牛血清的FPS液4 mL，吸取腹腔洗液，取0.5 mL洗液加入盛有1%鸡血红细胞悬液0.5 mL的试管内混匀，取0.5 mL混合液于玻片，37 ℃孵育15～20 min，生理盐水冲洗玻片，置甲醇液中固定1 min，再放入Giemsa溶液中染色15 min，最后用蒸馏水冲洗干净，晾干，用40×显微镜下计数细胞吞噬百分率和吞噬指数.

1.5.3 NK细胞活性测定

选用雌性小鼠4只，随机分为4组，连续给药30 d后，颈椎脱臼处死动物，无菌取脾，在FPS液中磨碎，经 1 000 r/min 离心洗涤后，用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，活细胞计数并调整浓度2×107个/mL.取靶细胞和效应细胞各100 μL(效靶比50∶1)，自然释放孔和最大释放孔分别加入培养液和2.5%Triton 100 μL，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养4 h，1 500 r/min 离心5 min，取上清液100 μL，加入LDH基质液100 μL，室温反应3～10 min，加入1 mol/L的HCL 30 μL，酶标仪测定490 nm处吸光度，计算NK细胞活性.

1.5.4 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法)

选用雌性小鼠60只，随机分为5组，连续给药30 d，颈椎脱臼处死动物，无菌取脾，置无菌Hank’s液中磨碎，经 1 000 r/min 离心洗涤后，将细胞悬于1 mL的完全培养液中，活细胞计数并调整浓度3×106个/mL.将脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1 mL，一孔加ConA液75 μL，另一孔作为对照，置37 ℃、5% CO2孵箱中72 h，培养结束前 4 h，每孔取上清液0.7 mL，加入不含胎牛血清的RPMI 1640培养液，加入MTT 50 μL，继续培养4 h，加入酸性异丙醇1 mL混匀，酶标仪测定570 nm处吸光度，计算淋巴细胞的增殖转化能力.

1.5.5 DNFB诱导小鼠迟发变态反应

选用雄性小鼠75只，随机分为5组，连续给药10 d，除空白组外，各组动物给药后1 h，在经氯化钡脱毛的腹部皮肤上均匀涂抹1% DNFB混合液 50 μL，给药第15 d，各鼠右耳两面均匀涂抹1% DNFB混合液10 μL，24 h后颈椎脱臼处死动物，剪下左右两耳，用直径8 mm打孔器于同部位切下双耳，称重，计算肿胀度；同时摘取胸腺和脾脏，称重，计算脏器系数.

1.5.6 血清溶血素的测定

选用雌性小鼠60只，按体重随机分为4组，连续给药25 d，每鼠腹腔注射5%绵羊红细胞悬液0.2 mL，继续给药5 d，末次给药后30 min，于眼眶静脉取血，放置1 h，4 000 r/min 离心10 min，取血清用SA缓冲液稀释100倍，依次取血清稀释液0.25 mL、10%绵羊红细胞悬液0.25 mL、补体0.25 mL，混合后于37 ℃恒温30 min，置0～4 ℃冰水中终止反应，离心，以不加小鼠血清(以SA缓冲液代替)的空白管调零，酶标仪测定540 nm处吸光度，计算半数溶血值(HC50).

1.6 统计分析

计量资料以X±SD表示，采用方差分析，方差齐，计算F值≥0.05，P≤0.05，用多个试验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计(采用LSD方法)比较试验组与对照组差异性，试验组显著水平取P=0.05，极显著水平P=0.01；对非正态分布或方差不齐的数据采用变量转换，或改用秩和检验进行统计分析.

2 实验结果

2.1 保元汤对小鼠非特异性免疫的影响

2.1.1 对小鼠碳廓清的影响

与空白组相比，保元汤对正常小鼠的碳廓清吞噬指数未见显著差异(P>0.05)，胸腺/体重比值和脾脏/体重比值也无显著性差异(P>0.05)，结果见表1.

表1 保元汤对小鼠碳廓清的影响

2.1.2 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能的影响

与空白组相比，保元汤3个剂量均可显著增加正常小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率(P<0.05)，各剂量对吞噬指数均无明显影响(P>0.05)，结果见表2.

表2 保元汤对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能的影响

注：与空白对照组相比，*/**P<0.05/0.01.

2.1.3 对小鼠NK细胞活性的影响

与空白组相比，保元汤各剂量对正常小鼠NK细胞活性均无增强作用(P>0.05)，结果见表3.

表3 保元汤对正常小鼠NK细胞活性的影响

2.2 保元汤对小鼠特异性免疫的影响

2.2.1 对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化的影响

与空白组相比，保元汤中、高剂量均表现出具有增强正常小鼠淋巴细胞转化能力的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，结果见表4.

表4 保元汤对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化的影响

2.2.2 对DNFB诱导小鼠迟发型变态反应的影响

与空白组相比，模型组小鼠耳片肿胀度显著增加(P<0.01)，胸腺系数显著降低(P<0.01)，脾脏系数未见明显影响(P>0.05)；与模型组相比较，保元汤3个剂量均可显著增加模型小鼠耳片肿胀度(P<0.05或P<0.01)，且呈现出一定的剂量相关性，具有增强正常小鼠细胞免疫功能；保元汤中剂量可显著增加小鼠胸腺系数(P<0.05)，结果见表5.

表5 保元汤对DNFB诱导小鼠迟发性超敏反应的影响

注：与空白对照组相比，**P<0.01；与模型对照组相比，△P<0.05，△△P<0.01.

2.2.3 对小鼠血清溶血素生成的影响

与空白组相比较，保元汤3个剂量均可显著促进正常小鼠血清溶血素的生成(P<0.05或P<0.01)，具有增强正常小鼠的体液免疫功能，结果见表6.

表6 保元汤对小鼠血清溶血素生成的影响

注：与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01.

3 讨论与结语

中医药对免疫的认识源远流长，早在两千多年前，我国古代医学著作中就有与免疫有关的记载，如《内经》中提到“正气存内，邪不可干”、“真气从之，精神内守，病安从来”等论点，其中真气就是机体抵抗病邪的“正气”[5].免疫力低下，即中医的“虚症”，以扶正固本作为治病的基本法则[6-7].保元汤用于治疗元气虚弱、精神倦怠、肌肉柔慢等虚症，通过调节五脏六腑气血的阴阳平衡来改善患者的免疫功能，提高患者的免疫力水平[8].现代药理研究发现，保元汤具有免疫调节、促进免疫细胞再生和改善造血功能等多种药理作用，临床上广泛用于气虚、免疫失调引起的多种疾病[9-10].

本实验研究结果表明，保元汤提取物以0.15、0.30、0.60 g/kg bw连续灌胃给药30 d，可通过增强小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬能力，增强正常小鼠非特异性免疫；连续灌胃给药15 d，可增强正常小鼠DNFB诱发的迟发型变态反应，具有增强正常小鼠特异性细胞免疫功能；连续灌胃给药30 d，可促进正常小鼠血清溶血素生成，具有增强小鼠特异性体液免疫功能.在增强细胞免疫、体液免疫、单核-巨噬细胞功能等3个方面结果均为阳性，说明保元汤提取物能增强正常小鼠的免疫功能，具有开发为增强免疫力功能产品的前景和优势.

在保元汤配方中具有增强免疫力功能的主要组分为人参、黄芪.根据文献[11-13]报道，人参、黄芪单用或配伍使用，均能不同程度增强小鼠多种免疫功能.本实验研究结果显示，保元汤提取物对小鼠碳粒廓清能力、NK细胞活性无显著影响、ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化无显著影响，与文献报道存在一定差异，可能是由于各实验对受试物或组分的剂量要求不同所致，也可能是由于受试物本身的作用特点所在，有待开展进一步的作用机制研究.