健脾活瘀方抑制IL-6/JAK1/STAT3信号通路抗胃癌前病变的机制研究

郭敏，王晓鸽，杨国红*，曾震军,刘香丽,彭小利，张樾亚

(1.河南中医药大学第一附属医院,河南 郑州 450000；2.河南中医药大学，河南 郑州 450046)

胃癌前病变(Precancerous lesions of gastric cancer，PLGC)是指萎缩性胃炎伴肠化生(IntestinalMetaplasia,IM)和异型增生(Dysplasia,Dys)的一种状态，是胃黏膜由正常向癌变转化的一个重要病理阶段。因此有效的逆转胃癌前病变是降低胃癌发生率和病死率的重要措施[1]。“炎-癌”转化理论在癌症中的作用越来越受到重视[2]，胃癌前病变向胃癌转化过程中，炎症是一个促进因素。研究发现,炎性因子白介素6(IL-6)介导的JAK1/STAT3通路在胃癌的发生发展中起着重要作用[3-6]。因此有效的干预IL-6/JAK1/STAT3信号通路有可能成为逆转胃癌前病变的关键。

本课题组经过前期大量临床研究表明[7]，健脾活瘀方治疗胃癌前病变疗效确切，具有减轻炎症反应、改善胃黏膜血流、降低氧自由基损伤、调节免疫功能、调控细胞增殖分化的作用，但其具体机制尚不清楚。本研究通过建立胃癌前病变大鼠模型，以“炎-癌”转化为切入点，基于IL-6/JAK1/STAT3通路进一步探讨健脾活瘀方防治胃癌前病变的作用机理。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠48只，体质量(110±20)g，购自郑州大学实验动物中心，合格证号：SCXK(豫)2015-0004。本动物实验经河南中医药大学第一附属医院动物实验伦理委员会审核批准，符合实验动物伦理委员会的要求。

1.2 药物及试剂

健脾活瘀方由四川新绿色药业提供。组方:党参15 g (批号:16100039),白术20 g(批号:16070098),茯苓20 g(批号:16070032),清半夏10 g(批号:16100135),陈皮10 g(批号:16100191),砂仁10 g(批号:17030139),木香15 g(批号:16100109),莪术15 g(批号:16120105),生薏苡仁30 g(批号:16100168),灵芝20 g(批号:16040057),三七粉3 g(批号:1610046),炙甘草6 g(批号:16040128)。

替普瑞酮[卫材(中国)药业有限公司，批号:1606030];大鼠白介素6(IL-6)ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；兔多抗甘油醛-3-3磷酸脱氢酶(GAPDH)(杭州贤至生物有限公司)；鼠单抗JAK1(133 KD)(武汉三鹰生物技术有限公司)；兔多抗SOCS3(25 KD)(武汉三鹰生物技术有限公司)；HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；蛋白marker(10～250 KD)(海利克思)。

1.3 仪器

显微镜(LEICA DM4000)；切片机(LEICA RM2245)；包埋机(LEICA EG1150H)；电热恒温培养箱(日本ASONE)；全自动酶标仪(美国,MDSpectraMax i3)；电泳仪(北京六一仪器厂)；电转仪(北京六一仪器厂)；酶标仪(美国，MDSpectraMax i3)；垂直电泳槽(北京六一仪器厂)；实时荧光定量PCR仪(ABI，QuantStudio 6)；微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司)；紫外分析仪(北京君意东方电泳设备有限公司)。

1.4 动物模型制备

除正常组外，余组采用单功能烷化剂甲基硝基亚硝基胍(MNNG)、乙醇、雷尼替丁、0.9%氯化钠综合造模，造模时间30周[8]。将体质量(110±20)g的SD雄性大鼠随机分成2组，其中对照组15只，实验组75只，分笼饲养于通风、光照12 h/12 h的房间里,室温16 ℃～25 ℃，相对湿度50%～70%。对照组给予0.9%氯化钠灌胃，每次2 mL，每日1次；实验组给予MNNG、乙醇、雷尼替丁、0.9%氯化钠综合造模，造模时间30周。第1～8周；灌服45%乙醇,每只2 mL,每周1次；第1～30周,给予雷尼替丁(0.03 g/kg)灌胃；雷尼替丁用0.9%氯化钠溶解,每次2 mL，每日1次，灌服乙醇当天不再进行雷尼替丁灌胃；MNNG用去离子水配成1 g/L的储备液,每周配制1次，于4 ℃冰箱避光保存，用前稀释为80 μg/mL浓度的溶液，装入用黑胶袋包裹的避光饮水瓶内给大鼠自由饮用，每日更换1次药液，直到造模第30周结束，各组处死动物取胃黏膜进行病理染色确定造模是否成功。造模期间每周称重1次，并根据体质量调整用药剂量。

1.5 分组及给药方法

将SD大鼠按随机数字表分为正常组、模型组、替普瑞酮组(15.6 mg/kg)和健脾活瘀方高、中、低剂量组，每组8只大鼠。依据丁虹主编《实验药理学》中人与动物每千克体重剂量折算法，高、中、低剂量组分别将健脾活瘀方用纯净水配成浓度为5.04 g/mL、2.52 g/mL、1.26 g/mL的混悬液(相当于50.4 mg/kg、25.2 mg/kg、12.6 mg/kg)，用药剂量为1 mL/(100 g·d)；模型组灌服同体积的纯净水1 mL/100 g。各组大鼠灌胃均每日1次，给药时间为10周。末次给药24 h 后，采大鼠腹主动脉血，分离血清，-80 ℃超低温保存；颈椎脱臼处死大鼠后，剖腹取胃，沿胃大弯剖开胃，用预冷的PBS漂洗，-80 ℃超低温保存。

1.6 指标检测

1.6.1 苏木精-伊红染色(HE染色)观察胃组织病理学变化

胃窦取材多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋、切片，HE染色，在光学显微镜下观察。

1.6.2 酶联免疫吸附法(ELISA)法测血清中IL-6的水平

严格按照ELISA试剂盒说明书的步骤进行标准品稀释，加样，温育，加抗体等操作，最后在450 mn波长下用酶标仪测量各孔的OD值。

1.6.3 PCR定量检测胃黏膜组织中JAK1及STAT3 mRNA的表达

引物序列见表1。用Trizol法提取总RNA，取2 μL RNA分光光度计测定其OD260、OD280检测其浓度及纯度，以检测RNA的完整性。用cDNA第一链合成试剂盒进行反转录，反应条件为：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 ，60 ℃ 30，40 cycles，绘制溶解曲线，最终数据以2-△△Ct进行分析。

表1 引物序列

1.6.4 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测胃黏膜组织JAK1、STAT3、SOCS3、c-Myc、Survivin的蛋白表达

组织总蛋白抽提，BCA法测定蛋白浓度。加入5×SDS上样缓冲液，100 ℃煮沸变性10 min，上样，电泳，转膜，封闭2 h。分别加入JAK1抗体(1∶2 000)、STAT3抗体(1∶2 000)、SOCS3抗体(1∶500)、c-Myc 抗体(1∶2 000)、Survivin抗体(1∶1 000)、GAPDH抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，洗膜，加入二抗(1∶50 000)，37 ℃孵育2 h，洗膜。ECL发光，蛋白质印迹成像系统中显色，照相，BandScan分析胶片灰度值，计算蛋白条带相对灰度值。

1.7 统计学处理方法

应用SPSS20.0统计软件，计量资料以均数±标准差表示，检验各组数据正态性及方差齐性，多组间比较用单因素方差分析，方差齐性时用LSD法，方差不齐时用Tamhane′s法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组病理形态学观察比较

见图1。HE染色结果显示，正常组：胃黏膜结构完整，由表面上皮及固有层组成，胃小凹由表面上皮内陷形成，胃小凹上皮与固有腺体的比例正常，固有腺体的层次与数目正常，腺体排列有极向，细胞无异型。模型组：胃黏膜局部病变呈中度异型增生(腺体排列紊乱，细胞核浆比增高，可见核分裂象)，周围胃黏膜呈轻-中度萎缩性炎(固有腺体层次及数目轻-中度减少)。健脾活瘀方高剂量组：大鼠胃黏膜呈粉红色，胃黏膜完整，偶见炎细胞浸润。健脾活瘀方中剂量组:呈轻度萎缩。健脾活瘀方低剂量组:呈轻度异型增生。替普瑞酮组:呈轻度萎缩，未见明显异型增生。

注：A：正常组，腺体的层次和数目正常；B：模型组，腺体呈中度异型增生，黑色三角示病理性核分裂像；C：健脾活瘀方高剂量组，胃黏膜大致正常，少量炎细胞浸润；D：健脾活瘀方中剂量组，胃黏膜轻度萎缩；E：健脾活瘀方低剂量组，胃腺体呈轻度异型增生；F：替普瑞酮组，胃黏膜轻度萎缩。图中黑色箭头示胃黏膜腺体。图1 健脾活瘀方对胃癌前病变大鼠胃黏膜形态的影响(HE染色，×200)

2.2 血清中IL-6的浓度比较

见表2。与正常组比较，模型组血清中IL-6的浓度均显著升高(P<0.05)，正常组、替普瑞酮组及健脾活瘀方各剂量组之间比较无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，各组血清中IL-6的浓度均显著降低(P<0.05)；健脾活瘀方各剂量组之间及与替普瑞酮组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

注：与正常组比较，1)P<0.05；与模型组相比，2)P<0.05；与替普瑞酮组比较，3)P<0.05。

2.3 胃黏膜组织中JAK1、STAT3 mRNA表达水平比较

见表3。与正常组比较，模型组大鼠胃黏膜组织中JAK1 mRNA及STAT3 mRNA水平均显著增加(P<0.05)；与模型组比较，健脾活瘀方高、中、低剂量组及替普瑞酮组的JAK1 mRNA水平显著降低(P<0.05)，健脾活瘀方高、中剂量组及替普瑞酮组的STAT3 mRNA水平显著降低(P<0.05)；与替普瑞酮组比较，健脾活瘀方高剂量组的JAK1 mRNA及STAT3 mRNA表达水平无差异，但健脾活瘀方中剂量组及低剂量组JAK1 mRNA及STAT3 mRNA表达增加(P<0.05)。

表3 各组胃黏膜组织中JAK1、STAT3 mRNA表达水平比较

注：与正常组比较，1)P<0.05;与模型组相比，2)P<0.05;与替普瑞酮组相比，3)P<0.05。

2.4 胃黏膜组织中JAK1、STAT3、Survivin、c-Myc、SOCS3蛋白表达的比较

见图2、表4。与正常组比较，模型组大鼠胃黏膜组织JAK1、STAT3、Survivin、c-Myc的蛋白表达水平显著增加(P<0.05)，而SOCS3蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，健脾活瘀方高、中剂量组及替普瑞酮组的JAK1、STAT3及c-Myc蛋白表达显著降低(P<0.05)，健脾活瘀方高、中、低剂量及替普瑞酮组的Survivin的蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)，健脾活瘀方高、中、低剂量组及替普瑞酮组的SOCS3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与替普瑞酮组比较，健脾活瘀方高、中剂量组的JAK1、STAT3、Survivin、c-Myc、SOCS3蛋白表达含量比较无统计学意义(P>0.05)。

注：A：正常组；B：健脾活瘀方高剂量组；C：健脾活瘀方中剂量组；D：健脾活瘀低剂量组；E：替普瑞酮组；F：模型组。图2 各组胃黏膜组织中JAK1、STAT3、Survivin、c-Myc及SOCS3蛋白表达的比较

表4 各组大鼠胃黏膜组织中JAK1、STAT3、Survivin、c-Myc、SOCS3蛋白含量比较

注：与正常组比较，1)P<0.05;与模型组相比，2)P<0.05;与替普瑞酮组相比，3)P<0.05。

3 讨论

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，据2009年统计，胃癌发病人数及病亡人数均占全球胃癌发病总人数的50%左右。因其病因不明，实施一级预防比较困难，故目前主要对胃癌进行二级预防, 逆转胃癌前病变, 阻断其向胃癌的发展, 是防治胃癌研究的关键。

目前认为“炎-癌转化”[9]在胃癌前病变向胃癌转化这一过程中起关键作用：炎症因子引起细胞增殖分化异常及其介导的机体抑癌基因失活、原癌基因激活，最终导致胃癌的发生。白介素6(interleukin-6，IL-6)是由多种组织和细胞所表达的一种炎症细胞因子，当IL-6[10-11]受体与配体结合后，在胞浆结合JAK1引发自身和JAKs的酪氨酸磷酸化，活化的受体JAK1募集胞浆内的 STAT3[12-16]并使其磷酸化，激活JAK/STAT途径，而此通路的激活与肿瘤的发生发展有着密切联系。

在“炎-癌” 转化的过程中，机体抑癌基因失活、原癌基因激活发挥着重要作用。Survivin 是凋亡抑制蛋白家族的新成员，具有抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的双重功能，是联系细胞周期和细胞凋亡的重要因子。较多研究表明,Survivin[17-20]过表达与胃癌发生、恶性增殖、侵袭转移及预后密切相关。原癌基因 c-Myc[21]是体内重要的转录因子，是胃癌中被激活的癌基因之一。SOCS(Suppressor of cytokine signaling，SOCS)[22]是JAK/STAT途径中的一种细胞因子信号抑制物，对JAK/STAT起负反馈调控。IL-6/JAK1/STAT3通路被激活后，导致促癌基因Survivin、c-Myc的激活和抑癌基因SOCS的失活，最终导致胃癌的发生。

胃癌前病变在中医学中属于“胃痞”“胃痛”等范畴，国医大师李振华教授提出“脾虚血瘀”是胃癌前病变的基本病机。健脾活瘀方以健脾活血为基本治疗原则，针对胃癌前病变的基本病机。健脾活瘀方在香砂六君子基础上加香附、莪术、薏苡仁、三七、灵芝组成。其中党参、白术、茯苓、甘草益气健脾；陈皮、半夏、砂仁和胃降逆；香附配陈皮、砂仁可疏肝理气;莪术破血行气[23-25]，与党参白术相配而不损真气；生薏苡仁渗湿健脾；灵芝益气补中；三七粉祛瘀生新，通补兼用，共奏健脾益气、活血化瘀之效。临床应用针对胃癌前病变疗效显著[26]，但对于其具体的作用机制尚不清楚。

本研究结果显示，健脾活瘀方高剂量组可逆转萎缩及异型增生，高、中剂量组可以明显降低血清IL-6水平，降低胃组织中JAK1、 STAT3 mRNA及蛋白的表达，降低胃黏膜组织中Survivin及c-Myc蛋白水平，提高SOCS3蛋白表达水平。

综上所述，健脾活瘀方干预胃癌前病变的的作用机制可能是通过抑制IL-6/JAK1/STAT3信号通路，上调抑癌基因SOCS3的表达、下调促癌基因 c-Myc、Survivin的表达，从而达到阻断炎-癌转化、起到治疗胃癌前病变的作用。