Cu2+、Zn2+胁迫对粉黛乱子草种子萌发及抗氧化特征影响

许志敏, 陈 琳, 刘燕珍, 林 涛, 何 侃, 丁国昌

(福建农林大学园林学院，福建 福州 350002)

近年来，重金属污染问题日益加剧，铜、锌、镉和铅已经成为主要的重金属污染元素[1-3]，其中全球每年释放到环境中的铜为14.7×104t，锌为27.6×104t[4]，对土壤质量、生态环境及人体健康等造成严重威胁[5].随着城市化和工业化的快速发展，重金属污染已不仅仅存在于尾矿区、周边农田和水体区域，城市中的不同功能区土壤重金属污染状况也日趋严峻.例如北京市城区存在广泛的镉、铜和锌污染，各功能区受土壤污染程度排名前3的为工业区>商贸区>公园区[6]；福州市各功能区重金属综合污染指数的排序为工业区>交通区>居住区>公园区，且各功能区均属于重度污染[7].同时，重金属污染往往是多种重金属复合污染.生物措施是修复重金属污染区域有效方式之一，但不同的植物种类或个体对重金属修复能力各不相同，因此开展高效修复能力的植物种类或个体及相关机制研究具有重要意义.

粉黛乱子草[Muhlenbergiacapillaris(Lamarck) Trinius]为禾本科乱子草属(Muhlenbergia)植物，是多年生暖季型观赏草，可在北京以南地区生长，具有生长速度快、生物量大、适应性强、管护方便等特性[8].夏秋季开放粉色雾状花序，如梦如幻，观赏价值极高，近年逐渐被应用于街头绿地、别墅庭院和观赏专类园等.目前针对粉黛乱子草的研究主要集中在生态适应性[9]、耐热耐旱性研究[10]、观赏价值评价[11]等方面，关于粉黛乱子草对不同重金属的耐受性研究鲜有报道，且铜锌复合胁迫对粉黛乱子草种子的萌发特性和生理响应机制还未见报道.

本试验采用不同质量浓度的铜、锌溶液及其混合溶液对粉黛乱子草种子进行胁迫处理，测定胁迫14 d后粉黛乱子草的各项种子萌发指标、幼苗生长指标及抗氧化酶活性指标，探究粉黛乱子草被铜、锌毒害后种子萌发特性和抗氧化酶活性的变化规律.利用隶属函数法，综合评析粉黛乱子草萌发期对3种不同重金属的耐受性.以期为粉黛乱子草耐重金属机理研究奠定基础，同时为各类土壤重金属污染区域的植被应用和生态修复提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料及处理

试验材料为粉黛乱子草种子，采购自江苏省沭阳县溢芳花卉园.用0.1%高锰酸钾溶液消毒浸泡种子15 min后，蒸馏水反复冲洗5～6遍，用蒸馏水浸泡24 h，除去漂浮的劣质种子，余下的种子用滤纸吸干表面的水分，用于胁迫试验.

1.2 试验方法

依据国家土壤环境质量标准值，铜和锌溶液分别采用CuSO4·5H2O和ZnSO4·7H2O配制(表1)，设置7个处理：T1、T2、T3、T4、T5、T6，以蒸馏水为对照(CK).培养条件为温度25 ℃、空气相对湿度75%、1 d内光照14 h，光照度6 000 lx，1 d内黑暗10 h.取直径9 cm的一次性培养皿，铺置1层脱脂棉和滤纸作为发芽床，每个培养皿50粒种子，每个处理重复6次，其中3个重复用于测定幼苗形态指标，另外3个重复用于测定萌发过程中抗氧化酶活性指标.培养期间每天通过向培养皿内增加相应的处理液以维持质量浓度基本不变并保持湿润.每天观察记录种子萌发情况.

表1 铜、锌及铜锌复合胁迫梯度值
Table 1 Gradient values for Cu2+, Zn2+, Cu2++Zn2+composite stress mg·L-1

溶液对照组(CK)处理组T1T2T3T4T5T6Cu2+050100200300500600Zn2+050100200400600800Cu2++Zn2+050+50100+100200+200300+400400+600500+800

1.3 指标测定

1.3.1 种子发芽指标测定 发芽以胚根露白为标准，每天定时观察记录种子发芽数[12].第4天统计种子发芽势，第14天[13]结束发芽试验，统计种子发芽率.

发芽率/%=第14天萌发种子数/种子总数×100

发芽势/%=第4天萌发种子数/种子总数×100

发芽指数=∑Gt/Dt(Gt指在t时间内发芽数，Dt为相应的萌发天数)[14]

活力指数=发芽指数×苗长度

1.3.2 形态学指标测定 第14天试验结束，从用于形态指标测定的培养皿中各取出10株长势一致的幼苗，用游标卡尺测量胚芽长和胚根长，读数精确到0.01 mm，用电子天平称量幼苗鲜重.

1.3.3 生理指标测定 第14天试验结束，从用于生理指标测定的培养皿中取出0.2 g幼苗，放置于5 mL的离心管后在球磨机内研磨成匀浆，加入4 mL的0.05 mol·L-1(pH=7.8)磷酸缓冲液于离心管中，于4 ℃下10 000 r·min-1冷冻离心20 min，取上清液立即放入4 ℃冰箱储存待测.参考王学奎[15]的方法测定丙二醛(MDA)含量、过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性和过氧化氢酶(CAT)活性.使用多功能酶标仪测定各指标的吸光度值.耐铜锌胁迫能力评价采用模糊数学中隶属函数值的方法进行抗逆性综合评定[16]：

隶属函数值的换算方法：

A：R(Xij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

B：R(Xij)=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

C：R(Xi)=Xij/n

式中：R(Xi)表示i处理j指标的耐铜锌隶属函数值，Xij表示i处理j指标的测定值，Xjmax和Xjmin分别表示各处理的最大和最小的测定值，Xi为i处理的耐铜锌隶属函数值的平均值，n为指标数.

1.4 数据处理

所有数据处理和统计分析均基于Excel 2010和SPSS 23.0软件进行，采用Excel 2010软件作图.运用One-Way ANOVA进行方差分析，有显著或极显著差异时用DUNCAN法进行多重比较.

2 结果与分析

2.1 胁迫对粉黛乱子草种子发芽率和发芽势的影响

3种胁迫对粉黛乱子草的发芽率均具有抑制作用，随溶液质量浓度的升高呈先增后减的趋势(图1).3种胁迫的溶液质量浓度为T1时，粉黛乱子草的发芽率均高于对照组(53.33%)；从T2后，发芽率均呈不同程度的下降趋势，锌胁迫时，下降幅度最小，从T3-T6浓度依次下降13.74%、18.75%、21.25%、42.49%；铜胁迫时，下降幅度最大，从T3-T6浓度依次下降76.24%、83.74%、86.26%、90.00%.3种胁迫的溶液质量浓度为T6时，发芽率达到最低值，抑制作用最显著，铜、锌和铜锌复合胁迫下的发芽率分别为5.33%、30.67%、12.67%.

3种胁迫随着溶液质量浓度的升高，发芽势均呈先增后减的趋势(图2).3种胁迫的溶液质量浓度为T1时，粉黛乱子草的发芽势均高于对照组(20.67%)，锌胁迫时最高(26.67%).3种胁迫的溶液质量浓度为T2时，发芽势逐渐下降，在T6时均达到最低，铜、锌和铜锌复合胁迫下的发芽势分别为0%、9.33%、3.33%.

不同小写字母表示差异显著(P<0.05).
图1 不同胁迫处理对粉黛乱子草种子发芽率的影响
Fig.1 Effects of different levels of stress on the gernination rate ofM.capillarisseeds

不同小写字母表示差异显著(P<0.05).
图2 不同胁迫处理对粉黛乱子草种子发芽势的影响
Fig.2 Effects of different levels of stress on the germination potential ofM.capillarisseeds

2.2 胁迫对粉黛乱子草种子发芽指数和活力指数的影响

粉黛乱子草的发芽指数随处理溶液质量浓度的升高呈先升高后降低的趋势(图3).在T1时，3种胁迫对粉黛乱子草的发芽指数均有促进作用.随着溶液质量浓度的升高，3种胁迫下的发芽指数呈现不同程度的下降趋势，其中，锌胁迫处理下的发芽指数下降幅度最小，在T3、T4、T5、T6处理时与对照相比分别下降了5.90%、10.89%、14.21%、 30.63%；铜胁迫下的发芽指数下降幅度最大，在T3、T4、T5、T6处理时与对照相比分别下降了75.09%、84.69%、91.14%、93.54%.

粉黛乱子草的活力指数与胁迫浓度呈反比(图4)，即处理溶液质量浓度越高，活力指数越低.在T1时，粉黛乱子草的活力指数与对照组无显著差异，且3种胁迫下的活力指数相近，分别为19.49、19.71、19.52.在3种胁迫下的T2浓度后，活力指数与对照组差异显著(P<0.05)，且处理溶液质量浓度越高，差异越显著.

不同小写字母表示差异显著(P<0.05).
图3 不同胁迫处理对粉黛乱子草种子发芽指数的影响
Fig.3 Effects of different levels of stress on the germination index ofM.capillarisseeds

不同小写字母表示差异显著(P<0.05).
图4 不同胁迫处理对粉黛乱子草种子活力指数的影响
Fig.4 Effects of different levels of stress on the vitality index ofM.capillarisseeds

2.3 胁迫对粉黛乱子草幼苗胚芽和胚根生长的影响

表2 不同浓度Cu2+、Zn2+处理下粉黛乱子草幼苗生长情况1)Table 2 Growth performances of 8 varieties of M.capillaris seedings under different levels of Cu2+ and Zn2+ stress

1)-表示没有根生长.表中同列间不同字母表示差异显著(P<0.05).

3种胁迫对粉黛乱子草幼苗的生长均具有抑制作用，幼苗出现不同程度的毒害效应(表2).随着3种胁迫浓度的增大，粉黛乱子草的胚苗长、胚根长和幼苗鲜重均呈递减趋势，并显著低于对照(P<0.05).在3种胁迫的各处理下，胚苗长、幼苗鲜重下降幅度和趋势相近；但胚根长的变化趋势存在差异，锌胁迫下的胚根生长情况明显优于铜胁迫和铜锌复合胁迫，其中，铜胁迫下的胚根长受到抑制作用最显著.在Cu-T4、Cu-T5、Cu-T6，Zn-T6，Cu+Zn-T4、Cu+Zn-T5、Cu+Zn-T6胁迫下，粉黛乱子草出现“无根苗”和芽苗幼小症状，且胚根长在铜胁迫和铜锌复合胁迫时显著低于锌胁迫.

2.4 胁迫对粉黛乱子草叶片MDA含量的影响

随着3种溶液质量浓度的增高，粉黛乱子草叶片的MDA含量呈逐渐升高的趋势(图5).3种胁迫的溶液质量浓度为T1时，MDA含量与对照相比均无显著差异； T2及以上时，铜、铜锌复合处理的MDA含量均显著高于对照(P<0.05)，而锌胁迫在T3及以上时，MDA含量显著高于对照组(P<0.05).当3种胁迫的溶液质量浓度达到T6时，铜、锌和铜锌复合胁迫处理的MDA含量分别是对照的2.92、2.36和3.17倍.

2.5 胁迫对粉黛乱子草叶片CAT活性、POD活性和SOD活性的影响

随着3种溶液质量浓度的增高，CAT活性均呈先升高后降低的趋势，均于T3时达到最高(图6).在T4时，3种胁迫下的CAT活性均急剧下降，铜、锌和铜锌复合胁迫胁迫时CAT活性较T3分别较低35.58%、52.31%和37.46%.随溶液质量浓度的升高，CAT活性持续下降，在T6时达到最低值，铜、锌和铜锌复合胁迫胁迫时CAT活性与对照组相比下降了71.11%、43.31%和58.37%.

不同小写字母表示差异显著(P<0.05).
图5 不同胁迫处理对粉黛乱子草叶片MDA含量的影响
Fig.5 Effects of different levels of stress on the MDA content ofM.capillarisleaves

不同小写字母表示差异显著(P<0.05).
图6 不同胁迫处理对粉黛乱子草叶片CAT活性的影响
Fig.6 Effects of different levels of stress on the CAT activity ofM.capillarisleaves

随着3种胁迫浓度的升高，POD活性均呈先升高后降低的趋势(图7).在T1浓度时POD活性均达到最高值，铜、锌和铜锌复合胁迫处理时较对照分别增高了7.16%、5.46%和3.15%.在T2胁迫时，POD活性开始下降，但均高于对照组.在T3胁迫后，铜、锌和铜锌复合胁迫下的POD活性均低于对照组，在T6胁迫时达到最低值，分别为170.46、169.85和167.87 μg·min-1.

随着3种溶液质量浓度的升高，SOD活性均呈先增后减的趋势(图8).在T1胁迫时，3种胁迫下的SOD活性较对照组均有所提高，铜、锌和铜锌复合胁迫的SOD活性分别较对照提高了3.58%、2.95%和4.44%.在T3胁迫时，SOD活性下降幅度大且显著低于对照；在T4胁迫后，SOD活性降低幅度趋势平缓；在T6胁迫时，3种胁迫下的SOD活性均达到最低值.

不同小写字母表示差异显著(P<0.05).
图7 不同胁迫处理对粉黛乱子草叶片POD活性的影响
Fig.7 Effects of different levels of stress on the POD activity ofM.capillarisleaves

不同小写字母表示差异显著(P<0.05).
图8 不同胁迫处理对粉黛乱子草叶片SOD活性的影响
Fig.8 Effects of different levels of stress on the SOD activity ofM.capillarisleaves

2.6 胁迫下粉黛乱子草种子萌发和幼苗生长的抗逆性综合评价

单一的指标评判植物对重金属的抗性存在一定的片面性，通过隶属函数法可将各指标进行综合评价[17].根据表3得知，3种胁迫处理下粉黛乱子草各测定指标的综合隶属函数值依次为CK>Zn-T1>Cu-T1>Cu+Zn-T1>Zn-T2>Zn-T3>Cu+Zn-T2>Cu-T2>Zn-T4>Cu+Zn-T3>Zn-T5>Cu-T3>Zn-T6>Cu-T4>Cu+Zn-T4>Cu+Zn-T5>Cu-T5>Cu+Zn-T6>Cu-T6.结果表明，粉黛乱子草在萌发期对3种重金属耐受性强弱依次为Zn2+>Cu2++Zn2+>Cu2+.

表3 不同处理下粉黛乱子草各测定指标的隶属函数值Table 3 Subordinate function values for the physiological indicators of M.capillaris under different stress

3 讨论与结论

种子萌发是植物感知外界环境的最初生命阶段，也是对外界环境最敏感的时期[18]，其期间的生长状况直接影响今后的生长发育、观赏价值及开发利用途径等.通过观察逆境胁迫对种子萌发和幼苗生长的影响，在一定程度上能够反映植物对逆境胁迫的耐性[19].

本研究结果表明，随铜溶液、锌溶液和铜锌混合溶液质量浓度的升高，粉黛乱子草的发芽率、发芽势和发芽指数均呈先增后减的趋势，当铜胁迫T1(50 mg· L-1)时、锌胁迫T1(50 mg· L-1)时、铜锌复合胁迫T1(50 mg· L-1+50 mg· L-1)时，粉黛乱子草的上述发芽指标高于对照，表明T1对粉黛乱子草种子萌发具有一定地促进作用；当铜胁迫T2(100 mg· L-1)时、锌胁迫T3(200 mg· L-1)时、铜锌复合胁迫T3(200 mg· L-1+200 mg· L-1)时，上述发芽指标开始受到显著抑制作用，且随质量浓度的升高抑制作用越强，这与孙金金等[20]研究重金属对草种子萌发的影响存在低促高抑效应一致.活力指数、胚苗长、胚根长和幼苗鲜重随3种溶液质量浓度的升高而逐渐下降，在T1胁迫时，幼苗生长受到显著抑制作用，且溶液质量浓度越高，抑制作用越强烈；3种胁迫对粉黛乱子草幼苗生长的抑制作用存在差异，表现为Zn2+>Cu2++Zn2+>Cu2+，这可能是其受到的毒害作用主要是由铜造成的，而锌在一定程度上缓解了部分毒害作用[21]，还有待于进一步研究.同时在3种胁迫处理的T6时，粉黛乱子草均出现“无根苗”，表明在3种重金属胁迫下，粉黛乱子草的根系比茎叶受害程度更加剧烈.夏晔[22]对重金属对小麦种子的萌发进行研究，结果表明，高浓度胁迫对小麦根的抑制作用大于芽，且亦出现“无根苗”.由于根是植物吸收水分和养分的器官[23]，粉黛乱子草的根与重金属溶液接触，导致根的重金属累积量以及受迫时间比胚苗长，因此胚根比胚苗受到的毒害作用更强[24].

逆境胁迫会影响植物体内抗氧化酶活性及其化学性质等，活性氧水平上升产生大量丙二醛，造成膜脂过氧化作用，阻碍植物正常生长[25].本研究结果表明，粉黛乱子草叶片的MDA含量与3种胁迫溶液质量浓度呈正比，这与王丽艳等[26]、孔德政等[27]研究结果一致.当3种处理溶液质量浓度为T1时，细胞的防御机制使MDA维持在一定的水平，使细胞膜处于稳定状态；当浓度超过临界值T3时，细胞内代谢失衡，自由基大量积聚，导致MDA含量大幅度的增加.CAT作为重要的酶促清除系统，在清除植物体内过氧化氢、维持氧自由基平衡、减轻逆境对植物的损害等方面具有重要作用[28].本试验中粉黛乱子草的CAT活性随胁迫浓度的增大呈先增后减的趋势.在3种处理溶液质量浓度为T3之前，粉黛乱子草CAT活性逐渐提高；而在T4后，CAT活性急剧下降，说明高质量浓度的重金属溶液使幼苗清除体内活性氧能力显著降低，自生的抗逆境能力亦大幅下降.不同重金属处理之间的CAT活性存在差异，表现为Zn2+>Cu2++Zn2+>Cu2+，这与粉黛乱子草在3种胁迫下的萌发特性受到抑制情形一致，有待进一步探究.

SOD和POD作为防止植物细胞中活性氧簇产生的重要抗氧化酶[29]，二者活性的提高与维持是植物抗逆境胁迫的重要生理基础[30].本试验中3种胁迫处理下粉黛乱子草的SOD和POD活性均呈先增后减的趋势，这与曹萌等[31]研究重金属对豌豆幼苗抗性生理指标的影响结果一致，表明了其抗逆的协同性，并共同组成了防御过氧化系统，抵抗不良环境条件对机体的破坏[32].当3种重金属胁迫浓度较低时，其SOD、POD活性有上升的趋势，表明粉黛乱子草具有一定的耐性；当3种重金属胁迫浓度升高时，高浓度的重金属离子会明显抑制抗氧化酶活性，导致活性氧的加剧释放，使植物生长发育受阻.

通过对3种重金属胁迫下粉黛乱子草的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、胚苗长、胚根长、幼苗鲜重、MDA、CAT、SOD、POD等参数的分析，可以较全面地评析粉黛乱子草萌发期对重金属耐受性.采用隶属函数法综合分析得出粉黛乱子草对3种重金属耐受性强弱依次为Zn2+>Cu2++Zn2+>Cu2+.本试验仅探讨在种子萌发期，单一铜、单一锌和复合铜锌胁迫条件下对粉黛乱子草种子的萌发特性、幼苗生长和抗氧化特征，对粉黛乱子草成年植株的抗逆解毒机制、富集转运规律、分子水平及细胞结构上的影响还有待进一步深入研究.