液基薄层细胞制片技术联合细胞DNA定量分析对良恶性胸腹水患者的诊断价值*

李楣， 张丽丽， 姚蓓， 夏静， 余文静， 肖娟， 候秋萍

(重庆市第十三人民医院 检验科， 重庆 400053)

肿瘤包含恶性肿瘤与良性肿瘤，胸腹水是肿瘤患者主要的临床症状，一旦发现应及时就医，以免延误最佳治疗时间[1-3]。临床上胸腹水可分为良性胸腹水和恶性胸腹水，不同原因导致的胸腹水的性质、治疗和预后截然不同，因此快速而准确地诊断其良恶性对原发病的治疗和预后均有重要意义[4-5]。液基薄层细胞制片技术的制片流程简便、特异性高，但敏感性低、需要经验丰富的医生参与阅片诊断，难以用于肿瘤的早期筛查[6-7]。现代研究表明，细胞脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)定量分析是建立在基因水平的、对细胞内DNA含量进行快速测量并自动分析的新技术，可用于胸腹水中细胞DNA的定量分析，但该方法容易受致病菌感染等因素的影响，出现DNA异倍体现象，特异性不高[8]。目前关于将液基薄层细胞制片技术联合细胞DNA定量分析进行胸腹水良恶性诊断的文献报道较少，且未有定论，因此本研究旨在探讨液基薄层细胞制片技术联合细胞DNA定量分析对良恶性胸腹水的诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料、主要试剂与仪器

1.1.1资料 收集2018年11月-2019年8月收治的疑似肿瘤患者的临床资料，且所有患者以组织病理学结果为金标准鉴别良恶性胸腹水，要求有肿瘤的组织病理学诊断依据(包括肺癌、乳腺癌和淋巴瘤等疾病)、首次接受液基薄层细胞制片及细胞DNA定量分析者、未接受肿瘤治疗者、年龄≥50岁，排除肝肾等重要脏器功能不全者、有血液系统疾病者、意识障碍者及临床资料不全者等。最终纳入疑似肿瘤患者97例，男性56例、女性41例，年龄50～71岁、平均(54.12±2.34)岁，体质量指数(body mass index, BMI)为(16.78±1.23)kg/m2，胸水55例、腹水42例，组织病理学诊断恶性肿瘤58例、良性肿瘤39例。

1.1.2主要试剂与仪器 巴氏染液试剂(湖北孝感德立森)，硫堇染色液(武汉兰丁医学)；DCT-06液基超薄细胞制片仪(湖北孝感德立森)，LD DNA-ICMIl细胞DNA定量检测分析仪(武汉兰丁医学)。

1.2 方法

1.2.1液基薄层细胞制片 收集患者胸腹水标本100 mL，3 000 r/min离心15 min，弃上清液，留取沉淀物检查；吸取沉淀加入到保存液中，上机制作液基薄层细胞涂片，固定、巴氏染色，400倍显微镜下阅片见可疑癌细胞或癌细胞为阳性[8]。

1.2.2细胞DNA定量检测与判断 收集患者100 mL胸腹水标本，方法同1.2.1，制作涂片，采用福尔根染色法对细胞核染色测量DNA含量(福尔根染色中的细胞核着色深浅度与DNA含量成正比)；通过光学自动三维移动平台对福尔根染色的细胞核进行自动扫描，测定细胞核的积分光密度值(integrated optical density,IOD)及核面积等99个参数，计算DNA指数(DNA index，DI)或DNA含量(c)大小判断细胞的异常情况，规定DI=1～2或DNA含量=2～4 c为正常细胞，DI=2～2.5或DNA含量=4～5 c为细胞增殖期，DI>2.5或DNA含量>5 c为异常细胞，判定为阳性[9]。

1.2.3联合检测 液基薄层细胞制片见可疑癌细胞或癌细胞，且DI>2.5或细胞DNA含量>5 c为异常细胞，判定为阳性[9]。

1.3 统计学分析

使用SPSS 20.0统计软件进行分析。以n(%)表示计数资料，与组织病理学诊断结果的一致率比较使用配对χ2检验，计算各检测方法对良恶性胸腹水鉴别诊断中的准确率、灵敏度、特异性、阴性及阳性预测值，其中诊断的准确率与灵敏度比较使用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同检查方法与组织病理学诊断结果的比较

液基薄层细胞制片检测可见典型的肿瘤细胞团，乳头样或腺样结构，细胞排列紊乱，细胞核增大，核仁明显，染色质粗，核膜不规则，诊断为可见癌细胞(图1)；细胞DNA定量分析可见大量异倍体细胞及异倍体细胞峰出现(图2)；不同检查方法与组织病理学诊断结果比较显示，液基薄层细胞制片、细胞DNA定量分析分别与组织病理学诊断阳性率相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，但联合检测与组织病理学诊断阳性率相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 不同检查方法的符合率

联合检测诊断符合率分别高于液基薄层细胞制片和细胞DNA定量分析，差异均有统计学意义(P<0.05)，但液基薄层细胞制片与细胞DNA定量分析诊断符合率的差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

图1 典型病例右侧胸腔积液标本液基薄层细胞制片(400×)Fig.1 A thin layer cell section of the right pleural effusion specimen of a typical case (400×)

注：A为细胞数量，仪器扫描可见大量异倍体细胞及异倍体细胞峰(标本号:D191360；被测细胞：4 855；参考细胞：0；>5 c细胞：551；细胞总数：4 855；二倍体细胞：984；被测细胞比例：100%；均值：1；标准差：0.029；变异系数；1.444)；B为细胞核面积，仪器扫描可见细胞核面积增大；DNA含量<5 c为正常。

图2 典型病例右侧胸腔积液标本的细胞DNA定量分析
Fig.2 DNA quantitative analysis of right pleural effusion specimen in a typical case

表1 不同检查方法良恶性肿瘤检出结果与组织病理学诊断结果比较[n(%)]Tab.1 Comparison of benign and malignant tumor detection results and histopathological diagnosis results by different examination methods[n(%)]

表2 不同检查方法良恶性肿瘤诊断符合率的比较[n(%)]Tab.2 Comparison of diagnostic accuracy of different examination methods for benign and malignant tumors[n(%)]

注：(1)与液基薄层细胞制片比较，P<0.05；(2)与细胞DNA定量分析比较，P<0.05。

2.3 诊断价值

联合检测诊断良恶性积液的灵敏度分别高于液基薄层细胞制片和细胞DNA定量分析，差异均有统计学意义(P<0.05)；液基薄层细胞制片、细胞DNA定量分析及联合检测间的特异性差异无统计学意义(P>0.05)；联合检测诊断的阴性预测值分别高于液基薄层细胞制片和细胞DNA定量分析，差异均有统计学意义(P<0.05)；液基薄层细胞制片、细胞DNA定量分析及联合检测间的阳性预测值差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

注：(1)与液基薄层细胞制片比较，P<0.05；(2)与细胞DNA定量分析比较，P<0.05。

3 讨论

正常情况下，胸腔内存在少量液体起到润滑作用，减少呼吸活动过程中胸膜间摩擦，维持心肺功能正常运转，一旦胸腹腔出现恶性肿瘤细胞浸润或炎症反应，便可导致胸腹腔积液，其性质也随之变化[10-12]。大部分肿瘤转移患者存在不同程度胸腹水，因此更早地发现癌前病变细胞，进行预防和相关临床处理，快速鉴别胸腹水的良恶性在临床中有重要意义[13]。

近年来，液基薄层细胞制片技术逐步用于胸腹水、尿液及痰液标本等非妇科领域脱落细胞学检查[14]。本研究结果表明，以组织病理学诊断结果为金标准，液基薄层细胞制片技术特异性较高，其与组织病理学诊断结果差异有统计学意义(P<0.05)，但其诊断良恶性肿瘤的灵敏度不高，这可能是由于液基薄层细胞制片技术通过对制片方式和流程的改善，优化了制片效果，提高了阳性检测率，一定程度上对传统细胞学中的部分缺点进行了弥补[15-16]。但该法主要是形态学定性诊断，采集的胸腹水中细胞数量水平较低，部分细胞形态较为相似，这些原因对疾病的鉴别判断带来了一定的影响，难以独立实现对癌症早期阶段的有效筛查[17]。因此液基薄层细胞制片技术仍然存在争议，本研究结果也和Inage等[18]研究结果类似。

细胞DNA定量分析技术具有对流动状态下的细胞进行快速、大量及多参数分析的特点，临床价值及准确度较高[19]。正常人体细胞的DNA含量较为恒定，为2倍体细胞；当细胞进入分裂期时，细胞DNA含量增加甚至倍增，形成4倍体细胞[20]。在细胞癌变时，染色体的结构和数目均会发生异常，出现DNA异倍体，DNA异倍体细胞的出现是判断恶性肿瘤细胞的标志之一[21-23]。本研究通过对样本细胞核内DNA的含量或染色体倍体的测定来判断细胞的生理状态和病理改变，结果显示，以组织病理学诊断结果为金标准，细胞DNA定量分析与组织病理学诊断结果有统计学意义(P<0.05)，其诊断符合率及灵敏度处于居中位置，均高于液基薄层细胞制片，但低于联合检测方法，这可能是由于患者的胸腹水中存在分裂时期的病变细胞，即异倍体，且在细胞恶变过程中细胞DNA含量早于细胞形态发生改变，但细胞DNA定量分析系统仅能判断DNA倍体已经发生变化的肿瘤细胞，对未发生改变的肿瘤细胞不能测定。这也与Bisht等[24]研究结果相符。此外，联合检测诊断的阴性预测值分别高于液基薄层细胞制片和细胞DNA定量分析，差异均有统计学意义(P<0.05)；但液基薄层细胞制片与细胞DNA定量分析诊断符合率的差异无统计学意义(P>0.05)。上述结果表明，液基薄层细胞制片检查是医师根据细胞形态学的改变所做的判断，主观性较强、易漏诊，特异性较高[25-26]；细胞DNA定量方法灵敏度较液基薄层细胞制片方法高且更为客观，但特异性较低[27]。联合检测可提高恶性胸腹水的诊断阳性率，特别是对液基薄层细胞诊断不明确，无法判定良恶性时，细胞DNA定量分析辅助判断细胞良恶性，提高诊断阳性率，降低漏诊和误诊发生率[28-29]。因此，液基薄层细胞制片和细胞DNA定量分析具有较好的互补性，联合使用较单项检查灵敏度均有提高，可以克服单项检查固有的一些缺陷，具有较高的临床应用价值，有利于患者疾病的治疗，提高治疗有效率，在临床诊断中应大力推广应用[30]。

综上，液基薄层细胞制片技术联合细胞DNA定量分析胸腹水良恶性性质具有较高的诊断符合率、灵敏度和阴性预测值，在良恶性胸腹水患者的诊断中具有较高的应用价值，定性和定量相结合，优势互补，值得推广应用。