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加味芪黄饮激活InsR-IRS-1-PI3K-GLUT4信号通路延缓糖尿病肾病的研究

2020-06-03赵威蒙向欣李娟李辉远

广东药科大学学报 2020年3期
关键词:系膜肾小球低剂量

赵威,蒙向欣,李娟,李辉远

(广州医科大学附属中医医院肾病科,广东 广州 510130)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病严重的微血管并发症,是导致终末期肾脏病的常见原因之一,严重危害患者的生命健康[1]。研究表明,胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是糖尿病患者的重要临床特征,同时也是DN发生发展的独立危险因素[2]。胰岛素受体(insulin receptor,InsR)、胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、葡萄糖转运体4(glucose transporter 4,GLUT4)是胰岛素信号转导通路的重要组分,其组成的InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4信号通路与IR密切相关[3]。前期研究表明,具有“益气养肾、化瘀清利”功效的自拟方——加味芪黄饮在治疗DN中疗效确切[4-6],但其具体机制目前尚未阐明。本文拟通过观察加味芪黄饮对DN大鼠的治疗作用,研究其对IR状态和InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4信号通路的影响,以期为加味芪黄饮治疗DN提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 3月龄雄性Sprague-Dawley大鼠,40只,SPF级,体质量250~300 g,购自南方医科大学实验动物中心,生产许可证号:SCXK(粤)2016-0041。

1.1.2 试剂与仪器 加味芪黄饮由广州医科大学附属中医医院中药制剂室提供;链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(美国Sigma公司);碘(125I)胰岛素放射免疫分析药盒(北京科美东雅公司);兔抗鼠InsR多克隆抗体、兔抗鼠IRS-1多克隆抗体、兔抗鼠PI3K多克隆抗体、兔抗鼠GLUT4多克隆抗体(英国Abcam公司);辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的羊抗兔IgG(美国CST公司);RM2135型石蜡切片机(德国LEICA公司);IX71型普通荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS公司);全自动生化分析仪(日本日立公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)肾病大鼠模型[7]大鼠适应性喂养1周后,随机分为正常组(n=10)和DN组(n=30)。正常组:大鼠全程予普通饲料喂养。DN组:大鼠全程予高糖高脂饮食(66.5%常规饲料+20%蔗糖+10%猪油+2.5%胆固醇+1%胆酸盐),喂养8周后,禁食24 h,空腹状态下以1% STZ按45 mg/kg一次性腹腔注射,正常组大鼠予等量枸橼酸钾缓冲液处理。1周后,尾静脉取血测定大鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)水平,当FBG>13.9 mmol/L时,表明T2DM模型建立成功(共30只)。STZ注射后2周,代谢笼收集两组大鼠24 h尿液,检测24 h尿白蛋白(24-hour urinary albumin,24 h UAlb)水平,当24 h UAlb>正常组均值3倍时,表明T2DM肾病模型制备成功[8]。

1.2.2 分组及给药方法 将T2DM肾病大鼠随机分为正常组、模型组、加味芪黄饮低、高剂量组(以下简称低剂量组、高剂量组),每组各10只。低、高剂量组大鼠每日分别予加味芪黄饮400 mg/kg、800 mg/kg灌胃治疗,正常组、模型组大鼠则分别予等量生理盐水处理,总疗程共12周。

1.2.3 血、尿生化指标检测 12周后检杀大鼠,代谢笼收集24 h尿液行24 h UAlb定量;尾静脉取血,全自动生化分析仪检测各大鼠血肌酐(serum creatinine,Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、FBG等指标,放射免疫法检测大鼠空腹胰岛素(fasting insulin,FIns)水平,并计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR),HOMA-IR=FIns×FBG/22.5。

1.2.4 肾组织HE染色检查及MEI评分 留取大鼠肾组织标本,以4%(φ)多聚甲醛固定、石蜡包埋后,制成厚度2 μm组织切片并行HE染色,光镜下观察肾组织病理变化。按文献[9]描述的方法,半定量肾小球系膜增生指数(mesangial expansion index,MEI):200倍光镜下,每张切片随机选择15个肾小球,每个肾小球按系膜增生程度分为0~3分(0:正常肾小球;1:肾小球基质增生达0~50%;2:肾小球基质增生达50%~75%;3:肾小球基质增生达75%~100%),取其均值作为每组大鼠的MEI评分。

1.2.5 免疫组化检测肾组织中InsR、IRS-1、PI3K、GLUT4蛋白表达 取2 μm肾组织切片常规脱蜡、水化,3% H2O2室温孵育5 min;将切片浸泡于0.01 mol/L枸橼酸钠溶液(pH 6.0)中,高温(95 ℃,10 min)抗原修复;10%(φ) BSA室温封闭10 min,分别滴加兔抗鼠InsR一抗(1∶100)、IRS-1一抗(1∶100)、PI3K一抗(1∶100)和GLUT4一抗(1∶100),湿盒内4 ℃冰箱孵育过夜;继而分别滴加HRP标记的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000),湿盒内室温孵育60 min,DAB显色,苏木素复染,常规脱水、透明、封片。按文献[10]描述的方法,每例切片在200倍光镜下随机选取10个不连续视野,利用高清晰度彩色医学图文分析系统,测定肾组织中上述相关蛋白吸光度值。

2 结果

2.1 各组大鼠24 h UAlb、Scr、BUN、FBG、FIns、 HOMA-IR测定

与正常组比较,模型组大鼠24 h UAlb、Scr、BUN、FBG、FIns、HOMA-IR水平均明显升高(P<0.01);与模型组比较,加味芪黄饮低、高剂量组大鼠24 h UAlb、Scr、BUN、FBG、FIns、HOMA-IR均降低(P<0.05),且随剂量增大,其下降趋势更为显著(P<0.05)(表1、表2)。

2.2 各组大鼠肾组织病理变化及MEI评分

HE染色观察肾组织病理变化,正常组大鼠:肾小球结构正常,肾小球基底膜、系膜细胞、系膜基质未见明显增生,肾小管形态正常。模型组大鼠:肾小球肥大,肾小囊腔狭窄呈裂隙状,肾小球基底膜、系膜细胞、系膜基质弥漫性增生,肾小管上皮细胞可见空泡和颗粒变性。低剂量组、高剂量组大鼠:肾小球和肾小管病理损伤程度均较模型组减轻,且随药物剂量增加,减轻程度更显著(图1)。半定量各组大鼠MEI评分,结果见图2。

2.3 各组大鼠肾组织中InsR、IRS-1、PI3K、GLUT4蛋白表达

与正常组比较,模型组大鼠上述相关蛋白表达均下调(P<0.05);与模型组比较,加味芪黄饮低、高剂量组上述蛋白表达升高(P<0.05),且随剂量增大,各蛋白升高程度更趋明显(P<0.05)(图3,表3)。

表1 各组大鼠24 h UAlb、Scr、BUN测定Table 1 Levels of 24 h UAlb,Scr and BUN of rats in each

与正常组比较:*P<0.01; 与模型组比较:#P<0.05; 与低剂量组比较:△P<0.05。

表2 各组大鼠FBG、FIns、HOMA-IR测定Table 2 Levels of FBG,FIns and HOMA-IR of rats in each

与正常组比较:*P<0.01; 与模型组比较:#P<0.05; 与低剂量组比较:△P<0.05。

注:图A、B、C、D:200×; 图 E、F、G、H:400×

图1各组大鼠肾组织病理改变(HE染色)
Figure1Pathologic morphology in renal tissue of rats in each group (HE staining)

正常组模型组低剂量组高剂量组3.53.02.52.01.51.00.50.0MEI*##△

与正常组比较:*P<0.01; 与模型组比较:#P<0.05;与低剂量组比较:△P<0.05。

图2各组大鼠肾小球MEI评分

3 讨论

随着生活水平的提高和饮食结构的改变,DN在人群中的发病率日益增高,不仅严重危害人类身体健康,也给社会带来沉重的经济负担[11]。DN属于祖国医学“消渴”“水肿”“尿浊”“虚劳”等病范畴,其多为本虚标实之证,本虚责之肝、脾、肾虚,标实则多为痰湿、湿浊、淤血,故其治疗当以补益肝脾肾为本,固其封藏,正其开阖,兼以祛痰除湿,活血化瘀。加味芪黄饮是本研究小组根据祖国医学治疗消渴虚劳之名方——六味地黄丸化裁而来,方中以黄芪为君,取其补气健脾,利水祛湿,摄血藏精之效;辅以太子参补中益气,生津复血;生地黄滋补肾阴,兼清虚热;山茱萸滋补肝肾,涩精固脱;山药、茯苓健脾补虚,泽泻利湿泄浊,丹皮、溪黄草清热解毒,女贞子、白茅根、蝉蜕止血,诸药相伍,共奏“益气养肾、化瘀清利”之功。本研究采用加味芪黄饮治疗DN大鼠,可降低大鼠24 h UAlb、Scr、BUN水平,改善肾组织病理损伤程度及MEI评分,这与前期的研究结果一致[4-6],说明加味芪黄饮治疗DN疗效确切。

IR是糖尿病的重要病理表现,是指胰岛素作用的靶器官对胰岛素的敏感性降低,机体需要过量的胰岛素才能发挥生物效应的一种状态[12]。HOMA-IR是评估IR状态的重要指标,实验结果显示,加味芪黄饮治疗DN大鼠,可降低大鼠FBG及FIns水平,从而降低HOMA-IR,改善DN大鼠的IR状态。IR在DN的发生发展中起重要作用,在DN大鼠模型中,IR可通过促进IL-1、IL-6等相关炎症因子表达,导致大鼠血肌酐、尿蛋白水平升高[13]。在DN小鼠模型中,IR可通过促进肾小球系膜细胞及系膜基质增生,加重肾组织病理损伤[14]。因此猜想:加味芪黄饮可能通过改善DN的IR状态,从而延缓DN的进展。

InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4是胰岛素信号传导的重要通路,其表达水平高低与IR状态呈负相关[15]。正常情况下,当胰岛素抵达靶细胞时,可先与靶细胞上的InsR结合并引起InsR磷酸化,磷酸化的InsR一方面为其他分子提供结合位点,另一方面可磷酸化其下游的IRS-1,磷酸化的IRS-1进一步激活其下游的PI3K,使信号以激酶链式反应下传,最终导致细胞内GLUT4合成、分泌、移位,GLUT4是直接影响葡萄糖进入细胞的因子,直接影响血糖的调节[16-17]。

图3各组大鼠肾组织中InsR、IRS-1、PI3K、GLUT4蛋白表达(DAB显色,200×)
Figure3Expression of InsR,IRS-1,PI3K and GLUT4 in renal tissue of rats in each group (200×)

表1 各组大鼠肾组织中InsR、IRS-1、PI3K、GLUT4吸光度值Table 1 Absorbance values of InsR,IRS-1,PI3K and GLUT4 in renal tissue of rats in each group

与正常组比较:*P<0.05;与模型组比较:#P<0.05;与低剂量组比较:△P<0.05。

本研究结果显示,模型组与正常组大鼠相比,InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4通路中各蛋白表达水平均下调,使用加味芪黄饮治疗后,上述各蛋白表达水平升高,且该效应具有一定量效关系,提示加味芪黄饮可能通过激活InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4信号通路,进而改善IR状态。

综上所述,加味芪黄饮治疗DN疗效确切,其可能通过激活InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4信号通路,改善IR状态,最终延缓DN进展。

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