加味芪黄饮激活InsR-IRS-1-PI3K-GLUT4信号通路延缓糖尿病肾病的研究

2020-06-03赵威蒙向欣李娟李辉远

广东药科大学学报 2020年3期

赵威，蒙向欣，李娟，李辉远

(广州医科大学附属中医医院肾病科，广东广州 510130)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病严重的微血管并发症，是导致终末期肾脏病的常见原因之一，严重危害患者的生命健康[1]。研究表明，胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是糖尿病患者的重要临床特征，同时也是DN发生发展的独立危险因素[2]。胰岛素受体(insulin receptor,InsR)、胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、葡萄糖转运体4(glucose transporter 4,GLUT4)是胰岛素信号转导通路的重要组分，其组成的InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4信号通路与IR密切相关[3]。前期研究表明，具有“益气养肾、化瘀清利”功效的自拟方——加味芪黄饮在治疗DN中疗效确切[4-6]，但其具体机制目前尚未阐明。本文拟通过观察加味芪黄饮对DN大鼠的治疗作用，研究其对IR状态和InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4信号通路的影响，以期为加味芪黄饮治疗DN提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 3月龄雄性Sprague-Dawley大鼠，40只，SPF级，体质量250～300 g，购自南方医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(粤)2016-0041。

1.1.2 试剂与仪器加味芪黄饮由广州医科大学附属中医医院中药制剂室提供；链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(美国Sigma公司)；碘(125I)胰岛素放射免疫分析药盒(北京科美东雅公司)；兔抗鼠InsR多克隆抗体、兔抗鼠IRS-1多克隆抗体、兔抗鼠PI3K多克隆抗体、兔抗鼠GLUT4多克隆抗体(英国Abcam公司)；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的羊抗兔IgG(美国CST公司)；RM2135型石蜡切片机(德国LEICA公司)；IX71型普通荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；全自动生化分析仪(日本日立公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)肾病大鼠模型[7]大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组(n=10)和DN组(n=30)。正常组：大鼠全程予普通饲料喂养。DN组：大鼠全程予高糖高脂饮食(66.5%常规饲料+20%蔗糖+10%猪油+2.5%胆固醇+1%胆酸盐)，喂养8周后，禁食24 h，空腹状态下以1% STZ按45 mg/kg一次性腹腔注射，正常组大鼠予等量枸橼酸钾缓冲液处理。1周后，尾静脉取血测定大鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)水平，当FBG>13.9 mmol/L时，表明T2DM模型建立成功(共30只)。STZ注射后2周，代谢笼收集两组大鼠24 h尿液，检测24 h尿白蛋白(24-hour urinary albumin,24 h UAlb)水平，当24 h UAlb>正常组均值3倍时，表明T2DM肾病模型制备成功[8]。

1.2.2 分组及给药方法将T2DM肾病大鼠随机分为正常组、模型组、加味芪黄饮低、高剂量组(以下简称低剂量组、高剂量组)，每组各10只。低、高剂量组大鼠每日分别予加味芪黄饮400 mg/kg、800 mg/kg灌胃治疗，正常组、模型组大鼠则分别予等量生理盐水处理，总疗程共12周。

1.2.3 血、尿生化指标检测 12周后检杀大鼠，代谢笼收集24 h尿液行24 h UAlb定量；尾静脉取血，全自动生化分析仪检测各大鼠血肌酐(serum creatinine,Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、FBG等指标，放射免疫法检测大鼠空腹胰岛素(fasting insulin,FIns)水平，并计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR),HOMA-IR=FIns×FBG/22.5。

1.2.4 肾组织HE染色检查及MEI评分留取大鼠肾组织标本，以4%(φ)多聚甲醛固定、石蜡包埋后，制成厚度2 μm组织切片并行HE染色，光镜下观察肾组织病理变化。按文献[9]描述的方法，半定量肾小球系膜增生指数(mesangial expansion index,MEI)：200倍光镜下，每张切片随机选择15个肾小球，每个肾小球按系膜增生程度分为0～3分(0：正常肾小球；1：肾小球基质增生达0～50%；2：肾小球基质增生达50%～75%；3：肾小球基质增生达75%～100%)，取其均值作为每组大鼠的MEI评分。

1.2.5 免疫组化检测肾组织中InsR、IRS-1、PI3K、GLUT4蛋白表达取2 μm肾组织切片常规脱蜡、水化，3% H2O2室温孵育5 min；将切片浸泡于0.01 mol/L枸橼酸钠溶液(pH 6.0)中，高温(95 ℃，10 min)抗原修复；10%(φ) BSA室温封闭10 min，分别滴加兔抗鼠InsR一抗(1∶100)、IRS-1一抗(1∶100)、PI3K一抗(1∶100)和GLUT4一抗(1∶100)，湿盒内4 ℃冰箱孵育过夜；继而分别滴加HRP标记的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)，湿盒内室温孵育60 min，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。按文献[10]描述的方法，每例切片在200倍光镜下随机选取10个不连续视野，利用高清晰度彩色医学图文分析系统，测定肾组织中上述相关蛋白吸光度值。

2 结果

2.1 各组大鼠24 h UAlb、Scr、BUN、FBG、FIns、 HOMA-IR测定

与正常组比较，模型组大鼠24 h UAlb、Scr、BUN、FBG、FIns、HOMA-IR水平均明显升高(P<0.01)；与模型组比较，加味芪黄饮低、高剂量组大鼠24 h UAlb、Scr、BUN、FBG、FIns、HOMA-IR均降低(P<0.05)，且随剂量增大，其下降趋势更为显著(P<0.05)(表1、表2)。

2.2 各组大鼠肾组织病理变化及MEI评分

HE染色观察肾组织病理变化，正常组大鼠：肾小球结构正常，肾小球基底膜、系膜细胞、系膜基质未见明显增生，肾小管形态正常。模型组大鼠：肾小球肥大，肾小囊腔狭窄呈裂隙状，肾小球基底膜、系膜细胞、系膜基质弥漫性增生，肾小管上皮细胞可见空泡和颗粒变性。低剂量组、高剂量组大鼠：肾小球和肾小管病理损伤程度均较模型组减轻，且随药物剂量增加，减轻程度更显著(图1)。半定量各组大鼠MEI评分，结果见图2。

2.3 各组大鼠肾组织中InsR、IRS-1、PI3K、GLUT4蛋白表达

与正常组比较，模型组大鼠上述相关蛋白表达均下调(P<0.05)；与模型组比较，加味芪黄饮低、高剂量组上述蛋白表达升高(P<0.05)，且随剂量增大，各蛋白升高程度更趋明显(P<0.05)(图3，表3)。

表1 各组大鼠24 h UAlb、Scr、BUN测定Table 1 Levels of 24 h UAlb,Scr and BUN of rats in each

与正常组比较:*P<0.01；与模型组比较:#P<0.05；与低剂量组比较：△P<0.05。

表2 各组大鼠FBG、FIns、HOMA-IR测定Table 2 Levels of FBG,FIns and HOMA-IR of rats in each

与正常组比较:*P<0.01；与模型组比较:#P<0.05；与低剂量组比较：△P<0.05。

注：图A、B、C、D：200×；图 E、F、G、H：400×

图1各组大鼠肾组织病理改变(HE染色)
Figure1Pathologic morphology in renal tissue of rats in each group (HE staining)

正常组模型组低剂量组高剂量组3.53.02.52.01.51.00.50.0MEI*##△

与正常组比较：*P<0.01；与模型组比较:#P<0.05；与低剂量组比较：△P<0.05。

图2各组大鼠肾小球MEI评分

3 讨论

随着生活水平的提高和饮食结构的改变，DN在人群中的发病率日益增高，不仅严重危害人类身体健康，也给社会带来沉重的经济负担[11]。DN属于祖国医学“消渴”“水肿”“尿浊”“虚劳”等病范畴，其多为本虚标实之证，本虚责之肝、脾、肾虚，标实则多为痰湿、湿浊、淤血，故其治疗当以补益肝脾肾为本，固其封藏，正其开阖，兼以祛痰除湿，活血化瘀。加味芪黄饮是本研究小组根据祖国医学治疗消渴虚劳之名方——六味地黄丸化裁而来，方中以黄芪为君，取其补气健脾，利水祛湿，摄血藏精之效；辅以太子参补中益气，生津复血；生地黄滋补肾阴，兼清虚热；山茱萸滋补肝肾，涩精固脱；山药、茯苓健脾补虚，泽泻利湿泄浊，丹皮、溪黄草清热解毒，女贞子、白茅根、蝉蜕止血，诸药相伍，共奏“益气养肾、化瘀清利”之功。本研究采用加味芪黄饮治疗DN大鼠，可降低大鼠24 h UAlb、Scr、BUN水平，改善肾组织病理损伤程度及MEI评分，这与前期的研究结果一致[4-6]，说明加味芪黄饮治疗DN疗效确切。

IR是糖尿病的重要病理表现，是指胰岛素作用的靶器官对胰岛素的敏感性降低，机体需要过量的胰岛素才能发挥生物效应的一种状态[12]。HOMA-IR是评估IR状态的重要指标，实验结果显示，加味芪黄饮治疗DN大鼠，可降低大鼠FBG及FIns水平，从而降低HOMA-IR，改善DN大鼠的IR状态。IR在DN的发生发展中起重要作用，在DN大鼠模型中，IR可通过促进IL-1、IL-6等相关炎症因子表达，导致大鼠血肌酐、尿蛋白水平升高[13]。在DN小鼠模型中，IR可通过促进肾小球系膜细胞及系膜基质增生，加重肾组织病理损伤[14]。因此猜想：加味芪黄饮可能通过改善DN的IR状态，从而延缓DN的进展。

InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4是胰岛素信号传导的重要通路，其表达水平高低与IR状态呈负相关[15]。正常情况下，当胰岛素抵达靶细胞时，可先与靶细胞上的InsR结合并引起InsR磷酸化，磷酸化的InsR一方面为其他分子提供结合位点，另一方面可磷酸化其下游的IRS-1，磷酸化的IRS-1进一步激活其下游的PI3K，使信号以激酶链式反应下传，最终导致细胞内GLUT4合成、分泌、移位，GLUT4是直接影响葡萄糖进入细胞的因子，直接影响血糖的调节[16-17]。