日本荚蒾ITS序列的克隆与分析

应梦豪, 马佳莹, 邬张颖,戴晨宇, 徐丽娜, 杨如棉, 朱 欣, 李彦蓉, 蒋 明

(台州学院 生命科学学院, 浙江 椒江 318000)

荚蒾属(Viburnum)植物为忍冬科(Caprifoliaceae)灌木或小乔木，落叶或常绿[1]。全世界约有荚蒾属植物200种，大部分种类分布于亚洲和南美洲；我国有70多种，各省区均有分布[2]。荚蒾属植物花冠洁白，偶见淡红色，具有一定的观赏价值，目前在园林绿化和美化中得到了较为广泛的应用。荚蒾属有些植物具放射状大型不孕花，有较高的观赏价值，部分物种已应用于园林绿化或美化；有些种类具有较高的药用价值，如天目琼花(V.opulusvar.calvescens)、宜昌荚蒾(V.erosum)、球核荚蒾(V.propinquum)和茶荚蒾(V.setigerum)等，其根、茎、叶或果实均可入药，含萜类、黄酮类和香豆素等；此外，荚蒾属植物在酿酒与食品工业有一定的应用，可用于制作果酱、糕点和饮料等[1, 3]。日本荚蒾(V.japonicum)为常绿灌木或小乔木，分布于浙江省的上大陈岛、雀儿岙岛和东福山岛等，在日本和韩国也有少量分布，由于数量十分稀少，日本荚蒾已被列为浙江省极小种群拯救物种[4-7]。

有关日本荚蒾的研究主要集中在扦插繁殖、光合特性和生理生化等方面[8-10]，而该物种分子生物学方面的研究鲜见报道。用于植物研究的分子手段主要有SRAP(Sequence Related Amplified Polymorphism，相关序列扩增多态性)、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)、SSR(Simple Sequence Repeats，简单序列重复)和rDNA ITS(Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer，核糖体DNA内转录间隔区)等。植物rDNA ITS由位于18S与5.8S之间的ITS1和位于5.8S与28S之间的ITS2组成，其中，ITS1和ITS2序列受环境选择压力较小，能保持较高的变异，已成为种质资源鉴定、系统发育分析和植物分类研究的重要分子标记[11]。目前，有关日本荚蒾rDNA-ITS序列的研究鲜见报道。为此，以日本荚蒾为材料，在克隆rDNA ITS序列的基础上，进行序列分析和比对，以明确序列特征和系统发育地位，为日本荚蒾的分子鉴定和遗传多样性研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

日本荚蒾的叶片，采自浙江台州上大陈岛。采集3个单株，将叶片置于冰盒带回实验室。先用大量自来水冲洗，再用无菌水浸泡后擦干，保存于-80℃的超低温冰箱备用。

仪器： C1000型PCR仪，美国伯乐； Gel Doc XR+凝胶成像系统，美国伯乐； DYY-12型电泳仪和电泳槽，北京六一；日本SANYO MDF-382E型超低温冰箱等。

试剂：DNA凝胶回收试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTP等购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；pEASY-T1载体和DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1基因组DNA的提取叶片加液氮磨成粉末，利用SDS法提取基因组DNA。DNA样品经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，用伯乐Gel Doc XR+凝胶成像系统拍照记录，DNA样品置于-20℃冰箱备用。

1.2.2ITS序列的PCR扩增根据NCBI中欧洲荚蒾(V.opulus)(KY860934.1)和樱叶荚蒾(V.prunifolium)(KY860928.1)的ITS序列设计PCR引物扩增日本荚蒾的ITS全长。引物序列分别为RBJMCUP(5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGT-3′)和RBJMCDN(5′-CGCTTATTGATATGCTTAAACTCAGCG-3′)。PCR扩增在C1000型PCR仪上进行，在PCR管中依次加入16.1 μL ddH2O、2.0 μL 10×缓冲液、0.6 μL dNTPs(10 mM)、0.2 μL上、下游引物(20 μM)、0.5 μL Taq DNA聚合酶(2 U/μL)和0.4 μL基因组DNA(80 ng/μL)。反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60.1℃退火1 min，72℃延伸90 s，共33个循环；72℃最后延伸10 min。

1.2.3PCR产物的回收、连接和测序PCR产物采用DNA凝胶回收试剂盒回收，操作根据说明书进行。取5 μL回收产物，与pEASY-T1载体连接，置于4℃冰箱约10 h，导入DH5α感受态细胞。经涂布、挑单菌落、液体培养和菌液PCR检测后，挑取3份阳性克隆的菌液用于测序。

1.2.4序列分析从NCBI数据库下载17条同源序列进行比对分析，分别是樱叶荚蒾(V.prunifolium)、醉鱼草状荚蒾荚蒾(V.buddleifolium)、聚花荚蒾(V.glomeratum)、皱叶荚蒾(V.rhytidophyllum)、金佛山荚蒾(V.chinshanense)、陕西荚蒾(V.schensianum)、鳞斑荚蒾(V.punctatum)、蒙古荚蒾(V.mongolicum)、宜昌荚蒾(V.erosum)、荚蒾(V.dilatatum)、美国琼花(V.opulusvar.americanum)、鸡条树(V.opulusvar.calvescens)、短芽荚蒾(V.brachybotryum)、珊瑚树(V.odoratissimum)、粉团(V.plicatum)、显脉荚蒾(V.nervosum)和克氏荚蒾(V.clemensiae)。采用DNAMAN软件统计GC值；利用ClustalX 1.81进行序列比对；采用MEGA 3.1计算遗传距离和构建系统发育树，构建方法为邻接法，经1 000 次自举检测[12-13]。

2结果与分析

2.1ITS序列PCR产物与序列

电泳结果表明，ITS-PCR产物的条带位于约600 bp处，条带单一、清晰，可用于割胶与回收(图1)。经回收、连接、转化和测序，得到ITS序列。测序结果表明，各样品的ITS序列完全一致。日本荚蒾的ITS全长617 bp，大小与预期一致(图2)。

M：DNA标准分子量；1：ITS-PCR产物。

M: DNA Marker; 1: ITS-PCR product.

图1 ITS-PCR产物的电泳结果

Fig.1 Electrophoresis results of ITS-PCR products

2.2ITS序列的特征

18种荚蒾属植物ITS全长607～617 bp，其中日本荚蒾ITS序列最长，宜昌荚蒾和鳞斑荚蒾次之，为615 bp，短芽荚蒾和粉团的ITS序列最短，分别为608 bp和610 bp。除宜昌荚蒾的5.8S序列长度为163 bp外，其余植物的5.8S均为164 bp。荚蒾属植物的ITS1序列长度为224～230 bp，鳞斑荚蒾的ITS1序列最长，为230 bp；ITS2序列长度为219～227 bp，日本荚蒾的ITS2序列最长，为227 bp；宜昌荚蒾次之，为225 bp；醉鱼草状荚蒾、聚花荚蒾、皱叶荚蒾、陕西荚蒾、蒙古荚蒾、短芽荚蒾和粉团的ITS2序列最短，均为219 bp。荚蒾属植物ITS1、5.8S和ITS2序列的GC 分别为59.8%～70.7%、50.0%～54.6%和53.4%～71.0%，其中日本荚蒾ITS1、5.8S和ITS2的GC分别为67.7%、54.2%和69.6%(表1)。

表1 18种荚蒾属植物ITS序列信息

2.3ITS序列的多重比较

18种荚蒾属植物的ITS序列变异丰富，其中ITS1上含86个变异位点和41个信息位点，分别占总位点数的37.39%和17.83%。聚花荚蒾、皱叶荚蒾和醉鱼草状荚蒾3种植物ITS1序列的组成和长度完全一致。鳞斑荚蒾ITS1序列较其他17种荚蒾属植物长，为18种植物中发生碱基插入最多的植物，共发生了6次碱基插入，分别在+57、+88、+89、+90、+91和+92处，其中3次为C碱基的插入，2次为G碱基的插入，1次为T碱基的插入。荚蒾在+188处发生碱基的缺失，另一缺失发生在+219处，美国琼花和鸡条树在该位点有C碱基的缺失。金佛山荚蒾在+21处存在转换，其在该位点的碱基为T，其余植物为C。C→T转换现象发生在+13、+21、+28、+98、+109和+220等位点，而A→G转换发生在+46、+53、+115、+124、+198和+200等位点。颠换现象发生在+39、+42、+102、+107、+119和+213等位点(图3)。与其他序列相比，日本荚蒾的ITS1共有12处变异，分别在+41、+45、+52、+53、+65、+127、+190、+204、+214、+218、+220和+229处：在+41、+45、+52、+65、+190、+220和+229发生了C→T转换，而A→G转换仅发生在+53处，日本荚蒾在该位点的碱基为G；+127、+204和+218处存在着碱基颠换，+214处发生了G碱基的插入；其中在+52和+127处仅日本荚蒾存在变异，分别发生了C→T转换和C→A颠换。

2.4系统发育

18种荚蒾属植物的遗传距离在0～0.124，平均遗传距离为0.062。其中，鳞斑荚蒾和金佛山荚蒾的遗传距离最大，为0.124；醉鱼草状荚蒾、聚花荚蒾和皱叶荚蒾三者间的遗传距离相同，均为0；日本荚蒾与金佛山荚蒾的遗传距离最大，为0.114，亲缘关系最远，与宜昌荚蒾遗传距离最小，为0.015，亲缘关系最为接近。采用邻接法构建系统进化树，结果表明，18种荚蒾属植物在系统发育树上可分为6组：金佛山荚蒾、聚花荚蒾、醉鱼草状荚蒾和皱叶荚蒾聚为一组；陕西荚蒾和蒙古荚蒾单独聚为一组；日本荚蒾、荚蒾、宜昌荚蒾、美国琼花和鸡条树聚为一组；克氏荚蒾、显脉荚蒾、粉团、短芽荚蒾和珊瑚树聚为一组，鳞斑荚蒾和樱叶荚蒾聚为一组；外类群忍冬单独聚为一组(图4)。

3结论与讨论

真核生物rDNA的18S、5.8S和28S序列在进化上十分保守，而其间的ITS序列则能保留较多的变异，具有结果稳定和重复性高等优点，广泛应用于遗传多样性、亲缘关系分析和系统发育等方面[13-14]。李金博等[15]利用ITS研究15个白三叶(Trifoliumrepens)品种的遗传多样性，可将其分为三大类，可用于遗传多样性分析。罗小珍等[16]以产于广西的6种十大功劳属(Mahonia)植物为材料，研究其间亲缘关系发现，阔叶十大功劳(M.bealei)、小果十大功劳(M.bodinieri)和十大功劳(M.fortunei)之间的关系最为接近。李建强等[17]对水青冈属(Fagus)6种、1变种和1栽培变种的ITS片段进行分析发现，与形态学分类存在一定的差异，而与地理分布格局较为一致。王晓锋等[18]测定黄杨属(Buxus)的ITS序列认为，珍珠黄杨(B.sinicavar.parvifolia)并非瓜子黄杨(B.sinica)的变种，珍珠黄杨与大花黄杨(B.henryi)的亲缘关系相对较近。研究以日本荚蒾为材料，在克隆其ITS序列的基础上，构建了同属植物的系统发生树，发现其与宜昌荚蒾处于同一分支，支持率达99%。

ITS1和ITS2在进化中所受的压力较小，可产生丰富的变异和信息位点。蒋明等[19]通过测定11种石豆兰属(Bulbophyllum)植物的ITS序列表明，ITS1和ITS2间存在丰富的变异位点，可以用于石豆兰属植物的分子鉴定。樊杰等[20]克隆远志属(Polygala)7种植物的ITS序列结果显示，ITS1和ITS2序列的变异位点/信息位点分别为144/35个和88/18个，可用于区分远志属7种药用植物。吴琦等[21]利用ITS对2份金荞麦(Fagopyrumdibotrys)样品进行PCR扩增发现，2份金荞麦ITS序列分别检测到80个和66个多态性位点，可把两者区分开来。日本荚蒾和17种荚蒾属植物的ITS1与ITS2的变异位点各分别为86个和74个，其中信息位点分别为41个和29个，这些位点可用于鉴别此类植物。与ITS1和ITS2相比，5.8S为编码区，序列长度和组成较为保守。宜昌荚蒾的5.8S长度为163 bp，而日本荚蒾和其他荚蒾属植物的5.8S均为164 bp。在山茶属(Camellia)植物中，除少数植物的5.8S有碱基缺失外，其余5.8S的长度均为164 bp[22]。而当归属(Angelica)21种植物的5.8S长度完全一致，均为165 bp[23]。

在克隆珍稀植物日本荚蒾rDNA ITS的基础上，与17种荚蒾属植物的ITS比较分析结果表明，日本荚蒾的ITS全长为617 bp，ITS1、ITS2和5.8S序列长度分别为226 bp、227 bp和164 bp；荚蒾属植物ITS1和ITS2的变异位点各有86个和74个，其中信息位点分别为41个和29个；日本荚蒾和宜昌荚蒾之间的亲缘关系最近，在发育树上处于同一分支，支持率达99%。