不同氮水平下毛华菊形态性状的差异分析

张秋玲 杨秀珍 戴思兰 邱丹丹 董南希 李清清

(北京林业大学/园林学院/花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室/国家花卉工程技术研究中心/ 城乡生态环境北京实验室，北京 100083)

毛华菊(Chrysanthemumvestitum)作为菊花的重要起源种之一，遗传背景较简单，且瓣型变异覆盖度、连续性高，与栽培菊花亲缘关系近，是研究菊花生物学现象的重要材料[1-2]。丰富的形态变异多是由遗传上的差异和生境的多样性形成，同时也反映了植物对环境较强的适应性[3-4]。作为具有药用和抗性优良的野生花卉资源，自然条件下的毛华菊同样存在丰富的种下形态变异，尤其是花朵，在小范围的同一立地条件下毛华菊的花朵具有丰富的形态变异[5]。这种丰富的形态变化一方面受遗传基础的影响，另一方面可能受环境因素的影响，而环境中的营养水平是否存在调控作用目前尚需进一步研究。

氮作为“肥料三要素”之一的矿质元素，是植物氨基酸、核酸和蛋白质等含氮化合物的重要组成部分，而植物激素的合成同样需要含氮化合物，氮的供应与植物的整个生长发育过程密不可分，是对观赏植物影响较大的元素之一，与植物的开花调控紧密联系[6-8]。科学合理的氮水平能够使植物生长健壮，性状优良，而氮肥供应不足或过多，会导致植物生长发育不良，引起一系列不良后果。

表型的变异是生物遗传变异最直接的表现，同时也是遗传多样性研究的重要内容[9-10]。研究表明，较低水平的硝酸盐供应会影响植物的生长速率，低氮能促进拟南芥提前开花；另一方面，氮饥饿或者过量供氮均会延迟开花[6-7、11]。作为现代观赏园艺中观赏价值极高的植物之一，对菊花花色、花型、花期和种质资源等方面的研究均取得了较大的进展，而从形态角度探讨矿质营养对其观赏性状的调控机制仍需进一步研究。因此，本研究旨在通过对混合瓣型毛华菊表型性状的研究，探讨毛华菊各形态特征在不同氮水平条件的栽培下的差异，以期为进一步解析氮素调控菊花观赏性状分子机制的研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

材料来源于河南省内乡县的野生毛华菊，在大东流苗圃试种之后，采集外植体到北京林业大学花卉工程实验室进行组织培养扩繁。待组培苗长到5～6片叶，于2018年10月7日选取生长一致的组培苗移入10 cm×9 cm的塑料盆中，栽培基质为珍珠岩，每盆珍珠岩装至距离盆沿1 cm，每盆一株，移到长日照人工气候室生长，至12～14片叶时(12月11日)移入短日照人工气候室。人工气候室培养温度为24±2 ℃，光照时间分别为 16 h/8 h和12 h/12 h，光源为白炽灯，平均光照强度3 000 lx。

1.2 试验方法

试验氮处理设15、30、60和90 mg/L共4个水平，采用单因素完全随机设计，重复12次，一个处理的12盆统一置于530 mm×390 mm×43 mm的红色托盘中，其余元素采用霍格兰营养液配方。上盆后缓苗(期间仅浇灌自来水)20 d(10月28日)开始处理，每周浇灌一次营养液，每次每托盘中浇营养液2 L，相邻2次处理之间视基质干湿情况浇水，共浇灌营养液11次。

1.3 测定指标及数据处理

上盆28 d开始每2周统计一次株高和叶片数，待其均现蕾停止统计；记录现蕾、破蕾和盛花日期，并计算从上盆至各时期的天数。2019年2月17日待各处理头状花均达到盛花时统一对头状花序的数量、花心直径、花序直径、花冠长、花冠开裂距离和舌状花类型进行统计。

株高利用钢卷尺测量；当花蕾达到1 mm时记录现蕾日期，花蕾破膜显色时记录破蕾日期，舌状花全部展开记录盛花日期；每个处理均采10朵头状花序利用毫米钢卷尺记录花心直径、花序直径、花冠长和花冠开裂距离，因15 mg/L氮水平处理开花数量较少，仅统计了完全盛开的3朵头状花。

试验数据使用Excle、SPSS进行分析；图形的绘制使用Origin 9.0软件进行处理和绘制。

2 结果与分析

2.1 不同氮水平下毛华菊株高的差异分析

如图1 所示，在上盆到98 d时，毛华菊的株高随着氮水平的增高呈递增趋势。4个处理下株高的增长以90 mg/L水平最快，15 mg/L水平下株高增长最慢。90 mg/L水平植株最终株高值最大，达到了40.80 cm；60 和30 mg/L水平的最终株高分别达到了35.13 和36.92 cm；15 与30 mg/L、60与90 mg/L 之间差异极显著(P<0.01)，30 与90 mg/L之间差异显著(P<0.05)，而60 与90 mg/L之间差异不显著。说明氮元素对毛华菊的株高生长至关重要，氮素缺乏毛华菊无法正常生长。

图1 不同氮水平对毛华菊株高的影响
Fig.1 Effect of different nitrogen levels on plant height ofC.vestitum

2.2 不同氮水平下毛华菊叶部性状的差异分析

2.2.1叶片数

随着上盆天数毛华菊的叶片数逐渐增加，最终呈缓慢增长直至停止(图2)。上盆28～42 d，毛华菊的叶片数增长缓慢，甚至15 mg/L处理的叶片数出现减少的趋势，这可能是前期组培苗幼小和氮素缺乏从而导致老叶脱落及新叶增长缓慢造成的；上盆42～84 d时，毛华菊处于营养生长的快速阶段，各处理毛华菊的叶片数增加迅速，以90 mg/L水平的增长速率最快。上盆84 d后，叶片数呈缓慢增长甚至停止增长，这可能由于毛华菊开始短日照诱导，进入了生殖生长所致。毛华菊的总叶片数随着氮水平的增加而增加，以90 mg/L水平的叶片数最多，15 mg/L水平下叶片数较少。说明氮素对毛华菊的叶片生长影响显著，尤以营养生长阶段的作用最显著，进入生殖生长阶段毛华菊的叶片数基本不再增长了。

图2 不同氮水平对毛华菊叶片数的影响
Fig.2 Effect of different nitrogen levels on the number of leaves ofC.vestitum

2.2.2叶片大小和形状

不同氮水平下毛华菊的叶长、叶宽和叶长宽比变化呈规律性变化趋势(图3(a)和(b))。各水平下毛华菊叶长和叶宽均随着氮水平的升高而增大，长宽比大小依次为30 >15 >90 >60 mg/L水平。显著性分析显示，15 和30 mg/L水平的叶长与60 和90 mg/L水平的叶长之间的差异分别达到了极显著水平(P<0.01)，15 与30 mg/L、60 与90 mg/L之间的差异显著(P<0.05)；15与30 mg/L水平的叶宽与60 和90 mg/L水平的叶宽之间的差异分别极显著(P<0.01)，而15 与30 mg/L、60 与90 mg/L水平之间的差异则不显著(P>0.05)；叶片长宽比以15、30、90 与60 mg/L水平之间的差异显著(P<0.05)。说明随着氮水平的升高，毛华菊的叶片也随之增大。

毛华菊的叶片形状在不同氮水平下具有差异，叶缘的开裂程度随着氮水平的增加而增加(图3(a))，而60与90 mg/L水平的长宽比更小也造成了该氮水平下植株的叶片更偏于卵圆形，15与30 mg/L水平的叶片更接近于狭长型，该变化原因还有待进一步的探究。

2.3 不同氮水平下毛华菊花部性状的差异分析

2.3.1开花时间

如表1所示，对不同氮水平下毛华菊开花时间的统计发现，随氮水平升高，毛华菊上盆—现蕾、破蕾和盛花的时间逐渐缩短，以90 mg/L水平的植株开花时间最早，以15 mg/L水平的植株开花时间最晚。通过显著性比较发现，各氮水平之间的开花时间差异均达到了极显著水平，上盆—现蕾的天数，最早与最晚之间差了14 d，上盆—破蕾的天数，最早与最晚之间差了16 d，上盆—盛花的天数，最早与最晚之间差了22 d，说明氮素对毛华菊的开花时间起到了重要的调控作用，严重氮饥饿会导致生长延迟和开花晚。

2.3.2头状花形态性状

毛华菊头状花形态性状的观测结果如表2所示。单株毛华菊的头状花数量以90 mg/L水平最多，达到了29.40，15 mg/L水平最少，仅3.50，二者差异显著(P<0.05)，15与30 mg/L、60与 90 mg/L 水平间的花序直径差异显著(P<0.05)。舌状花的平瓣、匙瓣和管瓣在不同氮水平下的差异并不显著，平瓣类型随着氮的升高数量呈一定的递增趋势，管瓣类型在15与30 mg/L水平下数量少于60与 90 mg/L 水平，管瓣类型则是以15与 30 mg/L 水平多于60与90 mg/L水平。单个舌状花总数和花心直径在不同氮水平下并无显著差异，舌状花总数均为13～14。说明氮素对毛华菊花部性状的影响主要集中在头状花数量和花序大小上，对舌状花数和花心直径并无显著影响。

图3 不同氮水平对毛华菊叶片大小的影响
Fig.3 Effect of different nitrogen levels on leaf size ofC.vestitum

表1 不同氮水平对毛华菊开花时间的影响
Table 1 Effects of different nitrogen levels on flowering time ofC.vestitumd

氮水平/(mg/L)Nitrogenconcentration上盆—现蕾Transplant to visibleflower bud stage上盆—破蕾Transplant to visiblecolor stage上盆—盛花Transplant to openedflower stage15100 AB124 AB134 AB30 90 BC114 BC126 BC60 88 CD111 CD115 CD90 86 D108 D112 D

注：表中同列不同小写字母表示处理间在0.05水平差异显著，大写字母表示处理间在0.01水平差异极显著。

Note: Different lowercase letters within the same column indicate that the difference between treatments is significant at the 0.05 level, and the uppercase letters indicate that difference between treatment levels at the 0.01 level is extremely significant.

2.3.3舌状花开裂程度(S值)

除观赏园艺学中对菊花舌状花“瓣型”的几大基本分类之外[12]，为便于对毛华菊性状观测工作的顺利进行，将舌状花花冠开裂部分与花冠全长的比例定义为S值。对不同氮水平下毛华菊舌状花的开裂程度进行统计，并将S值的范围划分为6个区间，分别为S=1.00、S=0.00、S∈(0.00,0.25】、S∈(0.25,0.50】、S∈(0.50,0.75】、S∈(0.75,1.00)，并对S值的数量进行了频次分布统计。

如图4((a)和b)及图5所示，通过对毛华菊S值的数量分布统计分析，发现舌状花S值的分布在S∈(0.00,0.25】、S∈(0.25,0.50】区间最多，结合之前对舌状花类型的统计，说明变异类型毛华菊的舌状花多集中在管匙瓣；其次为S∈(0.50,0.75】、S=1.00区间居多，以S∈(0.75,1.00)区间较少，S=0.00无。对不同氮水平之间比较发现，舌状花全管类型(S=1)以90 mg/L水平最多，与15 及 30 mg/L 间差异显著(P<0.05)，其次为60 mg/L水平较多；分布最多的S∈(0.00,0.25】区间，即舌状花花冠开裂程度较浅以低氮水平下分布数量较多，随氮水平的增加而减少；分布区间为S∈(0.50,0.75】，即开裂程度较深的舌状花在不同氮水平下差异不显著(P>0.05)；平瓣类型(S=0.00)仅在 60 mg/L 水平有少量分布。说明不同氮水平下毛华菊的舌状花或多或少均存在开裂，不存在完全闭合情况，且舌状花的开裂程度在不同氮水平下差异不显著。

图4 不同氮水平对毛华菊头状花(a)和舌状花S值(b)的影响
Fig.4 Changes in the head flower ofC.vestitumunder different nitrogen levels

图5 不同氮水平对毛华菊舌状花S值频次分布的影响
Fig.5 Effects of different nitrogen levels on the distribution ofSvalue frequency ofC.vestitum

2.4 不同氮水平下毛华菊各形态性状的差异特征

不同氮水平下毛华菊各形态性状均表现出了一定的差异性，为深入分析各形态性状的差异变化程度，特对其变异系数这一指标进行了比较分析。变异系数作为概率分布离散程度的归一化量度，反映了各指标观测值的离散程度[13]。如表3所示，各形态指标在不同氮水平下的差异程度从大到小依次为：平瓣数>匙瓣>管瓣数>单株头状花数量>单个花序舌状花数量>花序直径>株高>花心直径>叶片数>叶宽>叶长>叶长宽比。综合考虑毛华菊材料本身的特异性，个体之间的舌状花类型在自然条件下同样存在较大变异，花部性状的变异程度比叶部性状大，叶部性状相对比较稳定[2、5]。而在不同氮水平条件下栽培的毛华菊花部性状的差异程度较大，而叶部同样也出现了一定程度的差异变化。此外，不同水平的差异变化大小依次为60>15>30>90 mg/L。

表3 不同氮水平下各形态性状的差异变化特征Table 3 Degree of variation of various morphological traits under different nitrogen levels

3 结论与讨论

毛华菊作为栽培菊花的起源种之一，有着丰富的种下变异，包括丰富的花型和叶型变异，在解析其本身性状变异遗传机理的同时，也为研究现代栽培菊花性状的定向改良提供了较好的研究基础[2]。针对毛华菊性状差异与氮营养之间的关联研究，发现毛华菊的株高和叶片数随氮水平的变化而变化，叶长、叶宽和叶长宽比也呈规律性变化趋势。此外，氮素对开花时间存在显著调控，开花时间随氮水平的高低而不同，严重氮饥饿会导致生长延迟和开花晚，这与Lin等[7]在拟南芥研究中发现的结果一致，而这种潜在的调控机理还有待进一步解析。除舌状花类型、单朵花序的舌状花总数和花心直径外，花序直径和单株头状花数量在不同氮水平下存在显著差异，舌状花类型多集中在管匙瓣，不同氮水平下毛华菊头状花上的舌状花或多或少均存在开裂，不存在完全闭合。考虑到个体之间差异较大的原因，不同氮水平之间毛华菊舌状花类型的数量差异并不显著。

作为植物生长的基础元素之一，氮素影响了毛华菊整个生长发育进程。而通过对不同氮水平下毛华菊形态性状的差异分析，营养生长阶段，毛华菊的整体生长状态和速率随氮水平升高而呈递增趋势；生殖生长阶段，各生殖指标也随氮水平的变化呈现一定程度的差异，尤其是开花时间和头状花数量。这些结果均表明毛华菊的性状差异受到外界氮水平的调控，也为进一步解析毛华菊性状变异提供了新思路。

氮素在植物的生长发育过程中发挥着重要的作用，影响着园艺植物的观赏价值，植物体内许多重要有机化合物的组分，如蛋白质、叶绿素和酶等，都离不开氮的参与[14]。Allison等[15]对氮调控的根/芽系统转录网络分析，发现了21个响应氮元素的转录因子，其中转录抑制因子IAA17通过调控根系中谷氨酰胺合成酶响应氮的有效性，G蛋白通过响应氮的有效性从而调控了根系结构。在本研究中，氮素对毛华菊形态性状存在显著的调控，不仅在营养生长阶段，对于观赏植物较关注的观赏品质来说，科学施氮显著提前毛华菊花期，提高观赏价值，这对于改良菊花的观赏性状，丰富园艺植物营养学研究理论具有重要意义。且氮肥对观赏植物观赏品质的影响一直都是显而易见的，探究氮素对观赏植物的潜在调控也志在必行。此外，研究中的氮水平条件下，毛华菊的生长发育随氮水平的升高呈递增趋势，并未出现过量限制生长和开花的现象，对于在高氮水平下毛华菊的性状差异以及氮素与毛华菊性状差异之间的潜在调控网络还有待进一步的研究。