热休克预处理大鼠骨髓间充质干细胞对化疗诱导卵巢颗粒细胞凋亡的抑制作用

汪庆如，李欣然，王 清，谢嘉欣，付霞霏

0 引 言

随着化疗方案的不断改进,肿瘤患者的生存率逐渐提高,年轻女性化疗后的卵巢功能及生活质量不容忽视。大量研究表明,化疗药物可诱发卵巢颗粒细胞(granulosa cells，GCs)或卵母细胞凋亡,以及异常激活休眠卵泡池;也可直接损害卵巢周围血供,使卵巢组织纤维化，破坏卵巢内部结构和功能，导致卵巢储备减少, 生育能力下降, 最终导致卵巢功能不全[1]。因此, 积极寻求有效治疗化疗所致卵巢功能不全的方案, 最终改善卵巢功能及生育能力, 已成为临床亟待解决的难题。

近年来, 干细胞凭借多向分化潜能和自我复制能力被应用于修复卵巢组织和恢复其功能的实验研究, 为恢复患者卵巢功能及生育能力带来了希望。骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可进行自体移植而排除免疫排斥反应[2]，通过促进卵巢血管生成、改善卵巢颗粒细胞凋亡情况从而改善化疗所致的卵巢功能不全，修复卵巢功能[3]，但无法使卵巢功能恢复到正常水平，因此进一步寻求提高干细胞治疗功效的手段十分必要。提高移植干细胞的存活率是提高疗效的关键，前期研究已证实，热休克预处理可降低干细胞的凋亡率，提高干细胞的治疗效果[4]，但目前尚未有热休克预处理MSCs治疗化疗性卵巢功能不全的实验研究。

因此，本研究拟通过热休克预处理大鼠MSCs，研究热休克对干细胞的影响。进一步研究热休克预处理后的干细胞对化疗诱导的卵巢颗粒细胞的影响，明确热休克预处理MSCs是否具有抑制化疗诱导的卵巢颗粒细胞凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1主要实验动物具有正常动情周期的清洁级雌性Wistar大鼠，体重180～200g，由南方医科大学实验动物中心提供[实验动物合格证号SCXK(粤)2016-0041]。动物饲养条件：室温(23±2)℃，湿度45%～55%，光照时间12 h，通风良好, 标准饲料, 自由进食饮水，适应性饲养3～5 d。

1.2 骨髓MSCs的分离、培养及鉴定将大鼠以颈椎脱臼法处死后，用75%的乙醇浸泡5～10 min，在无菌条件下剥离胫骨和股骨，骨端剪除, 抽取DMEM完全培养基1 mL从一端将骨髓冲出, 制备单细胞悬液,制备成单细胞悬液，按1×106个细胞/mL将细胞接种于培养瓶中, 置于37 ℃, 5% CO2的饱和湿度培养箱中培养，每隔3天换1次液。待细胞铺满培养瓶约80%时进行1∶2传代，取第3代大鼠BMSCs, 制成单细胞悬液, 对细胞表面标志 CD44、 CD45、 CD29、CD34用流式细胞仪检测进行鉴定。选取生长状态良好的第3代大鼠骨髓MSCs进行后续实验。

1.3 大鼠GCs的分离、培养、形态观察及鉴定

1.3.1 大鼠GCs的分离及培养每只大鼠提前48 h注射皮下注射孕马血清(100 IU/只)，于麻醉后打开腹腔，在无菌条件下取出双侧卵巢，用含有1% 双抗的PBS漂洗，在含有1%双抗的DMEM/F12培养液中反复用针头刺破卵泡,轻轻将GCs压入培养液中制成细胞悬液。用200目细胞筛过滤细胞悬液去除多余残渣后，离心半径5.5 cm，1000 r/min离心10 min。弃上清液，细胞沉淀中加入含10%FBS的DMEM/F12培养基中重悬，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。48 h后进行观察，根据细胞状态做换液处理，每3天换液1次。

1.3.2 大鼠卵巢颗粒细胞的形态观察取生长旺盛第5天的大鼠GCs，使用0.25%含EDTA的胰酶在37 ℃培养箱中消化30 s, 弃去胰酶, 使用培养基终止消化并重悬细胞。将细胞接种于细胞爬片上, 继续培养48 h后取出爬片，PBS清洗3 min×3次;4%的多聚甲醛4 ℃固定20 min, PBS清洗5 min×3次。HE染色:苏木精染色3 min, 盐酸乙醇分化液分化15s，稍水洗, 氨水返蓝15 s,流水冲洗;伊红染色3 min,流水冲洗，脱水，透明，中性树脂封片, 显微镜下观察细胞形态。

1.3.3 大鼠卵巢颗粒细胞FSHR的表达鉴定将胰酶消化后的细胞接种于细胞爬片上, 培养48 h后取出爬片, PBS洗涤3 min×3次;4%多聚甲醛固定15 min, PBS清洗3 min×3次; 0.5%Triton X-100细胞通透液, 在室温条件下摇床上孵育通透20 min, PBS充分淋洗;在培养皿中加入5%BSA，37 ℃封闭30 min, PBS清洗3 min×3次;每个培养皿中滴加稀释好的一抗:FSHR(1∶500)，放入湿盒中，4 ℃孵育过夜。取出培养皿后室温静置45 min，PBS浸洗后，滴加聚合HRP标记抗兔IgG二抗工作液，37 ℃孵育30 min，PBS充分淋洗。DAB显色5～10 min，自来水冲洗1 min ；苏木精复染3 min，盐酸乙醇分化，返蓝；自来水冲洗1 min，脱水、透明、封固、镜检。

1.4 热休克预处理间充质干细胞前期研究表明，热休克预处理的最佳温度为42 ℃[5]，因此本实验热休克预处理的温度设定为42 ℃。我们的预实验探索了热休克预处理的最佳时间，结果表明42 ℃水浴1 h时MSCs的凋亡率最低，因此后续实验均采用的热休克预处理条件为42 ℃水浴1 h。

1.5 最佳热休克预处理条件下MSCs生物学特性的改变实验共分为4组：空白对照组、热休克对照组、模型组、热休克模型组。根据前期查阅文献，并进行相关预实验，最终选定顺铂作用剂量为5 mg/L[6]。空白对照组为不予其他处理的MSCs，热休克对照组为热休克预处理后的MSCs，模型组为顺铂(5 mg/L)作用后的MSCs，热休克模型组为热休克预处理后再予顺铂(5 mg/L)作用的MSCs。

1.5.1 CCK-8法检测细胞增殖能力在96孔板中按照2×104个/孔的细胞密度进行铺板，每孔体积100 μL，每组5孔细胞,待细胞贴壁生长后，每孔分别加入10 μL CCK8测试液，置于37 ℃，5% CO2培养箱中孵育1～4 h后，用全自动酶标仪检测 490 nm吸光度值A490。连续7 d重复此操作。

1.5.2 流式细胞仪检测MSCs的凋亡率各组细胞分别处理后继续培养72 h，收集单细胞悬液，使用流式细胞仪采用Annexin-V/PI方法检测MSCs凋亡率。

1.5.3 Hoechst33342/PI测定细胞存活率各组细胞分别处理后继续培养72 h，收集单细胞悬液至培养皿中，用固定液固定15 min后去除，并用 PBS浸洗3次，每次3 min；加入Hoechst33342染色液染色5 min后去除染色液，再用PBS洗3遍，每次3 min；加入PI染色液，置于4 ℃冰箱孵育30 min后去染色液，再用PBS洗3遍，每次3 min；吸尽液体，用抗淬灭封片液封固，于荧光显微镜下拍照。

1.6 热休克预处理MSCs对化疗药物诱导的GCs凋亡的影响实验分为4组：对照组、模型组、MSCs模型组、HS-MSCs模型组。对照组为未经处理的GCs；模型组为经顺铂(5 mg/L)作用后的GCs；MSC模型组、HS-MSCs模型组为GCs加入顺铂(5 mg/L)诱导凋亡后24 h分别与MSCs、HS-MSCs以1∶1比例加入Transwell培养板中实现GCs与MSCs的共培养,培养板上层以每个小室2×105个细胞加入MSCs、HS-MSCs，培养板下层加入GCs。各组加入含10%FBS的DMEM/F12完全培养基，置于37 ℃，5% CO2培养箱中继续培养，24 h后以流式细胞仪测定各组卵巢颗粒细胞凋亡率，以Hoechst33342/PI法测定卵巢颗粒细胞凋亡及存活率。

1.7 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计分析，多组间比较采用单向方差(One-way ANOVA)分析法，使用多重比较SNK法比较组间差异。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MSCs培养及鉴定培养MSCs细胞至第3代细胞，镜下观察细胞形态均一, 为成纤维细胞样的长梭形，见图1。经流式细胞仪检测结果：90%以上细胞为CD34和CD45阴性，CD44和CD29阳性，鉴定为非造血干细胞的间充质干细胞。

图 1 镜下观察大鼠MSCs形态( ×100)

Figure 1 Morphological observation of MSCs ( ×100)

2.2 大鼠卵巢颗粒细胞的观察及鉴定镜下观察原代大鼠卵巢颗粒细胞呈圆形或椭圆形, 大小不一。培养24 h后颗粒细胞贴壁，呈单层贴壁集落样生长,细胞质内可见颗粒样物质，见图2。HE染色后，显微镜下观察贴壁颗粒细胞呈多突行或梭形,细胞伸出伪足相互连接，细胞核增大呈圆形,细胞质颗粒均匀丰富，呈淡红色；FSHR为卵巢颗粒细胞特异性表达蛋白, 定位于细胞质。细胞中FSHR表达情况显示，95%以上的细胞质内有棕色目的蛋白表达，蓝紫色的为细胞核。见图3。因此可鉴定所培养细胞为卵巢颗粒细胞, 且纯度达到95%以上。

2.3 热休克预处理对间充质干细胞生物学特性的影响

2.3.1 热休克预处理增强MSCs的增殖能力实验结果表明，在第3、4天热休克对照组细胞增殖水平显著高于其他3组，与模型组相比，热休克模型组第3、4天细胞增殖水平显著增加(P<0.01)，提示热休克预处理促进MSCs增殖。见图3。

2.3.2 热休克预处理降低MSCs的凋亡率实验结果表明，热休克对照组MSCs的凋亡率显著低于其他3组，与模型组相比，热休克模型组凋亡率显著下降(P<0.05)，提示热休克预处理抑制MSCs凋亡。见图4。

2.3.3 热休克预处理增加MSCs的存活率经Hoechst33342/PI双染后，正常细胞呈现低蓝+低红荧光，凋亡细胞呈现高蓝+低红荧光，坏死细胞呈现低蓝+高红荧光。实验结果显示，热休克对照组中呈现低蓝+低红荧光表现的细胞比例较空白对照组多，热休克模型组呈现低蓝+低红荧光表现的细胞比例较模型组多，表明热休克对照组细胞存活率高于空白对照组，热休克模型组细胞存活率高于模型组，提示热休克预处理MSCs可提高细胞存活率。见图5。

a:电镜( ×100)； b:HE染色( ×400)；c:免疫组化染色( ×400)

图 2 镜下观察大鼠卵巢颗粒细胞形态

Figure 2 Observation of GCsafter staining

与模型组相比，*P<0.05；与空白对照组、模型组、热休克模型组比较，#P<0.05

图 3 热休克预处理后MSCs的增殖水平

Figure 3 The proliferation of MSCs after heat shock pretreatment

2.4 热休克预处理后卵巢颗粒细胞的凋亡与模型组凋亡率[(53.81±1.89)%)]相比，对照组、MSCs模型组、HS-MSCs模型组[(31.13±2.81)%、(42.76±0.99)%、(36.72±0.96)%]显著下降(P<0.05)；与MSCs模型组相比，HS-MSCs模型组凋亡率显著下降(P<0.05)。说明MSCs和HS-MSCs均能抑制顺铂诱导的颗粒细胞的凋亡，但HS-MSCs抑制效果更加明显。各组细胞经Hoechst33342/PI 双染后，HS-MSCs模型组及MSCs模型组呈现高蓝+低红荧光表现的细胞比例较模型组少，但MSCs模型组多于HS-MSCs模型组，说明MSCs和HS-MSCs均能一定程度抑制顺铂诱导的颗粒细胞的凋亡，但HS-MSCs抑制效果更加明显。见图6。

与模型组相比，*P<0.05；与空白对照组、模型组、热休克模型组比较，#P<0.05

图 4 热休克预处理后MSCs的凋亡率

Figure 4 The apoptosis rate of MSCs after heat shock pretreatment

图 5 Hoechst 33342/PI染色后各组MSCs凋亡或坏死( ×40)

Figure 5 The apoptosis or necrosis of MSCs detected by Hoechst 33342/PI staining ( ×40)

图 6 通过Hoechst 33342/PI染色检测各组GCs凋亡或坏死( ×40)

Figure 6 The apoptosis or necrosis of GCs detected by Hoechst 33342/PI staining ( ×40)

3 讨 论

近年来，各类肿瘤的发病率逐年上升，化疗药是治疗此类疾病的重要药物。顺铂是临床上常用的化疗药物, 有较强的细胞毒性。研究表明，顺铂可通过损伤卵母细胞和颗粒细胞, 进而影响卵泡生长和发育, 引起卵泡破坏和卵巢纤维化, 导致卵巢储备减少[7]，本实验中，我们采用在体外培养细胞中加入顺铂模拟化疗诱导细胞损伤，进一步研究MSCs对化疗微环境中卵巢颗粒细胞的影响。前期研究证实骨髓MSCs在体内外能抑制化疗药物诱导的卵巢颗粒细胞凋亡，部分修复化疗所致卵巢损伤[3, 8]，但不能完全恢复卵巢功能。移植后MSCs的大量凋亡、存活率低是导致治疗效果不佳的主要因素[9-10]，因此如何预处理MSCs、提高移植细胞的存活率是提高疗效的关键所在。

目前研究较多的MSCs移植前处理方法包括热休克预处理、缺氧预处理、及MSCs的遗传表观修饰等[9, 11]，其中热休克预处理具有方法简单、经济、安全、处理时间短等优点。热休克预处理常用的方法是42℃水浴[12]，然而关于热休克预处理的时间目前尚无统一标准。因此本实验选用4个时间点，研究不同的热休克预处理时间对间充质干细胞的的影响。我们的研究结果显示，42 ℃热休克预处理1 h能显著减少MSCs的凋亡，因此为MSCs的最佳预处理条件。我们的研究结果表明，42 ℃热休克预处理1h能显著降低骨髓MSCs的凋亡率，提高了干细胞的增殖能力及存活率。

研究表明，热休克预处理可以在细胞的增殖、分化、损伤和修复等生理过程中发挥作用，提高细胞对损伤因子的保护作用，在体外保护细胞免受各种环境损伤，提高移植细胞的存活率[10]。热休克预处理可产生热休克蛋白抑制P53的活性或者Bax的转位,使凋亡蛋白释放减少[13],也可增加移植细胞HSP70、HSP90的表达,进一步抑制Caspase表达及活化，从而抑制细胞凋亡[5, 14-15]。热休克预处理可提高干细胞对缺血再灌注损伤的修复率，增加对心肌起保护作用的金属硫蛋白的表达,减少线粒体细胞色素C的释放,从而进一步保护心肌细胞[16]。另外有研究表明，热休克预处理还可以产生少量的DNA双链断裂,诱导各种因子的保护作用，进一步减少细胞损伤[17-18]。在本实验中，我们建立了顺铂诱导卵巢颗粒细胞损伤的体外模型，探究热休克预处理MSCs对化疗诱导的卵巢颗粒细胞的影响，实验结果表明，经热休克预处理后的MSCs能更显著抑制卵巢颗粒细胞的凋亡，增加其存活率，与研究结果一致。

综上所述，热休克预处理MSCs的最佳条件为42℃热休克预处理1h，热休克预处理能抑制大鼠骨髓MSCs的凋亡，提高干细胞的存活及增殖能力，经热休克预处理的MSCs能显著抑制化疗诱导的卵巢颗粒细胞的凋亡，提示热休克预处理的MSCs对化疗药物诱导的大鼠卵巢损伤具有一定修复作用, 但其中的具体分子机制有待进一步探究。