灵芝三萜通过Wnt／β-catenin 信号通路对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

蔡 蕤

（郑州市第七人民医院药学部，河南 郑州450000）

肝癌是世界常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率和死亡率呈上升趋势［1］。据统计，2015 年全球肝癌发病率为85万，死亡率为81 万（高居世界恶性肿瘤第2 位），其中，乙型肝炎病毒感染和酗酒是引起肝癌患者死亡的主要原因［2-3］。虽然肝癌的临床治疗有手术、放疗、化疗、免疫治疗等多种形式，但其发病隐匿、易转移、复发率高，且放、化疗治疗不良反应较大，在改善肝癌患者生存率方面仍面临巨大挑战［4-5］。

传统中医药疗法是我国的特色治疗方式，应用范围广［6］。灵芝Ganoderma Lucidum是我国的一种传统名贵药材，具有补益五脏、止咳平喘、养肝护肝、补气安神的功效［7］。灵芝三萜是灵芝的主要成分之一，常用于肿瘤的辅助治疗［8］。已有研究［9］表明，灵芝三萜能够增强紫杉醇对乳腺癌细胞增殖的抑制和凋亡的作用，抑制异种移植瘤生长。本研究通过研究灵芝三萜对HepG2 人肝癌细胞增殖、凋亡及Wnt／β-catenin 信号通路的影响，探讨灵芝三萜预防及治疗肝癌的作用。

1 材料

1.1 细胞株 HepG2 人肝癌细胞（批号HB-8065） 购自美国模式培养物保存所。

1.2 药物与试剂 灵芝三萜（纯度为99 %） 购自杭州甫洛生物科技有限公司，溶解于二甲基亚砜；胎牛血清（批号12483012）、胰蛋白酶（批号20230）、二甲基亚砜（批号TS-20688） 购自美国Thermo Fisher 公司；RPMI-1640 培养液（批号21875-091） 购自美国Gibco 公司；XAV-939 通路抑制剂（批号S1180） 购自美国Selleck Chemicals 公司；LiCl 通路激活剂（批号A100416） 购自上海生工生物工程股份有限公司；Annexin V-FITC／PI 细胞凋亡检测试剂盒（批号40302ES20） 购自上海翊圣生物科技有限公司；双蒸水ddH2O （批号PER 018-1） 购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；PVDF 膜（批号BSP0161）、BCA 试剂盒（批号PC0020）、RIPA 裂解液（批号R0020） 购自北京索莱宝科技有限公司；MTT （批号M2129） 购自美国Sigma 公司；兔抗人p-GSK-3β多克隆抗体（批号SC-11757）、兔抗人βcatenin 多克隆抗体（批号NBP1-32239）、兔抗人GAPDH多克隆抗体（批号LS-C108027）、ECL 化学发光试剂盒（批号36208ES60） 购自上海煊翎生物科技有限公司；兔抗人c-myc多克隆抗体（批号EPR17924）、兔抗人cyclin D1多克隆抗体（批号EPR2241）、兔抗人caspase-3 多克隆抗体（批号ab13847）、兔抗人caspase-8 多克隆抗体（批号ab25901） 购自英国Abcam 公司。

1.3 仪器 MCO-18AC 型CO2培养箱购自日本SANYO 公司；流式细胞仪购自美国BD 公司；HBS-1096B 型酶标仪购自南京德铁实验设备公司。

2 方法

2.1 细胞培养 使用含10 % 胎牛血清的RPMI-1640 培养液于37 ℃、5 %CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养HepG2细胞，每隔2 d 换液1 次。

2.2 MTT 检测

2.2.1 不同浓度灵芝三萜对HepG2 细胞增殖的影响 待细胞生长至对数期，收集HepG2 细胞，胰酶消化并重悬，调整细胞浓度为1×106／mL 并接种至96 孔板。将细胞分为灵芝三萜低、中、高剂量组（10、50、100 μg／mL），按不同分组加入灵芝三萜处理HepG2 细胞24、48、72 h，加入20 μL质量浓度为5 mg／mL 的MTT，继续孵育4 h；弃去多余培养基，加入150 μL 二甲基亚砜振荡反应10 min，酶标仪检测490 nm 处吸光度值（OD）。每组6 个复孔，实验重复5 次。

2.2.2 灵芝三萜通过Wnt／β-catenin 信号通路影响HepG2细胞增殖 待细胞生长至对数期，收集HepG2 细胞，胰酶消化并重悬，调整细胞浓度为1×106／mL 并接种至96 孔板。将细胞 分为对照组 （DMSO）、灵芝三萜组（100 μg／mL）、XAV-939 组（20 μmol／L 抑制剂）、LiCl 组（20 mmol／L 激活剂）、灵芝三萜+ddH2O 组（100 μg／mL+ddH2O）、灵芝三萜+LiCl 组（100 μg／mL+20 mmol／L 激活剂）；细胞分别按不同分组加入药物处理24、48、72 h，MTT 处理按照“2.2.1” 项下MTT 处理方法。每组6 个复孔，实验重复5 次。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡

2.3.1 不同浓度灵芝三萜对HepG2 细胞细胞凋亡的影响 按照“2.2.1” 项下分组处理细胞，细胞常规培养24、48、72 h 后，加入胰酶消化，于4 ℃、300g条件下离心，收集细胞，利用Annexin V-FITC／PI 细胞凋亡检测试剂盒，依次加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI，轻轻混匀后于室温避光孵育15 min，置流式细胞仪检测细胞凋亡。

2.3.2 灵芝三萜通过Wnt／β-catenin 信号通路影响HepG2细胞凋亡 按照 “2.2.2” 项下分组处理细胞，按照“2.3.1” 项下流式细胞仪术方法检测细胞凋亡。

2.4 Western blot 检测 按照“2.2.2” 项下对照组、灵芝三萜组分组，细胞培养24、48、72 h，使用含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液置于冰上进行裂解，4 ℃、12 000g离心20 min，以提取蛋白。通过BCA 试剂盒测定蛋白浓度，取40 μg 蛋白样品进行SDS-PAGE 电泳。电泳结束后将蛋白样品电转至PVDF 膜上，将膜在含5 % 脱脂奶粉的TBST 液中室温封闭1 h；之后分别加入兔抗人c-myc 多克隆抗体（1 ∶1 000）、兔抗人cyclinD1 多克隆抗体（1 ∶1 000）、兔抗人caspase-3 多克隆抗体（1 ∶500）、兔抗人caspase-8 多克隆抗体 （1 ∶ 500）、兔抗人p-GSK-3β 多克隆抗体（1 ∶500）、兔抗人β-catenin 多克隆抗体（1 ∶500）、兔抗人GAPDH 多克隆抗体（1 ∶1 000），4 ℃孵育过夜；膜洗涤后加入辣根过氧化物酶（HRP） 标记的二抗室温孵育2 h；用TBST 洗膜，ECL 试剂盒显示条带。以GAPDH 为内参，检测蛋白表达，实验重复3 次。

2.5 统计学分析 采用SPSS 22.0 统计软件，数据以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P≤0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度灵芝三萜对HepG2 细胞增殖的影响 不同浓度灵芝三萜分别作用HepG2 细胞24、48、72 h，灵芝三萜抑制HepG2 细胞增殖（P＜0.05），且浓度越高，抑制作用越强。见表1。

表1 不同浓度灵芝三萜对HepG2 细胞增殖的影响（， n＝5）

表1 不同浓度灵芝三萜对HepG2 细胞增殖的影响（， n＝5）

注：与对照组比较，∗P＜0.05；与灵芝三萜低剂量组比较，#P＜0.05；与灵芝三萜中剂量组比较，△P＜0.05。

3.2 不同浓度灵芝三萜对HepG2 细胞凋亡的影响 与对照组比较，灵芝三萜组细胞凋亡率增加（P＜0.05），且浓度越高，细胞凋亡越多，见表2。100 μg／mL 灵芝三萜对HepG2 细胞增殖的抑制作用和细胞凋亡的促进作用最强，选取100 μg／mL灵芝三萜进行后续实验。

表2 不同浓度灵芝三萜对HepG2 细胞凋亡的影响（， n＝5）

表2 不同浓度灵芝三萜对HepG2 细胞凋亡的影响（， n＝5）

注：与对照组比较，∗P＜0.05；与灵芝三萜低剂量组比较，#P＜0.05；与灵芝三萜中剂量组比较，△P＜0.05。

3.3 灵芝三萜对HepG2 细胞增殖、凋亡相关蛋白表达的影响 与对照组比较，灵芝三萜（100 μg／mL）作用HepG2细 胞 24、48、72 h，c-myc、cyclinD1 蛋白表 达下调（P＜0.05），caspase-3、caspase-8 蛋白表达上调（P＜0.05），见图1、表3。

3.4 灵芝三萜对Wnt／β-catenin 信号通路相关蛋白表达的影响 与对照组相比，灵芝三萜 （100 μg／mL） 作用HepG2 细胞24、48、72 h，β-catenin、p-GSK-3β 蛋白表达下调 （P＜0.05）。提示100 μg／mL 灵芝三萜可能影响HepG2 细胞中Wnt／β-catenin 信号通路。见图2、表4。

图1 Western blot 检测各组细胞增殖、凋亡相关蛋白

3.5 Wnt／β-catenin 信号通路对HepG2 细胞增殖、凋亡的影响 20 μmol／L XAV-939 干预HepG2 细胞24、48、72 h，抑制HepG2 细胞增殖（P＜0.05），促进细胞凋亡率增加（P＜0.05）；而20 mmol／L LiCl 干预HepG2 细胞24、48、72 h，促进HepG2 细胞增殖（P＜0.05），抑制细胞凋亡率（P＜0.05）。见表5。

3.6 灵芝三萜通过Wnt／β-catenin 信号通路影响HepG2 细胞增殖、凋亡 单独以100 μg／mL 灵芝三萜作用HepG2 细胞24、48、72 h 能明显抑制细胞增殖（P＜0.05），并诱导细胞凋亡（P＜0.05）；而100 μg／mL 灵芝三萜联合20 mmol／LLiCl 干预HepG2 细胞24、48、72 h，细胞存活较灵芝三萜+ddH2O 组升高 （P＜0.05），同时细 胞凋亡 率降低（P＜0.05）。见表6。

表3 灵芝三萜对HepG2 细胞增殖、凋亡相关蛋白表达的影响（， n＝5）

表3 灵芝三萜对HepG2 细胞增殖、凋亡相关蛋白表达的影响（， n＝5）

注：与对照组比较，∗P＜0.05。

图2 Western blot 检测各组β-catenin、p-GSK-3β 蛋白

4 讨论

肝癌的发病率占世界恶性肿瘤的第6 位，其中我国肝癌患者占一半以上［10］。肝癌的发生与酗酒、丙型肝炎病毒感染、乙型肝炎病毒感染、身体质量指数（BMI）、糖尿病等因素有关，肝炎病毒疫苗接种、肝脏疾病早期筛查、使用中草药增强细胞免疫功能等方式能有效预防肝癌的发生［11-13］。灵芝三萜具有降血糖、降血脂、增强免疫、抗肿瘤等药理作用，可由担子菌门、伞菌纲、灵芝科灵芝中提取［14］。迄今为止，已有400 多个化合物从灵芝中分离并鉴定，其中150 多个为三萜类化合物，灵芝三萜是灵芝提取物中的主要活性成分［15-17］。有文献［18］报道，灵芝三萜能够阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡和自噬、抑制肿瘤转移和血管生成，从而发挥抑癌作用。Yue 等［19］研究发现，灵芝三萜通过参与细胞增殖、氧化应激、钙信号转导等生物过程在宫颈癌细胞中发挥抑癌作用；同时，Thyagarajan 等［20］研究发现，灵芝三萜能够调节自噬效应蛋白Beclin 1 表达，抑制p38 丝裂原活化蛋白激酶磷酸化，用于结肠癌的临床治疗。本研究低、中、高剂量的灵芝三萜均能有效抑制HepG2 人肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，且浓度越高、抑制或诱导作用越强。

表4 灵芝三萜对β-catenin、p-GSK-3β 蛋白表达的影响（， n＝5）

表4 灵芝三萜对β-catenin、p-GSK-3β 蛋白表达的影响（， n＝5）

注：与对照组比较，∗P＜0.05。

表5 Wnt／β-catenin 信号通路对HepG2 细胞增殖和凋亡的影响（， n＝5）

表5 Wnt／β-catenin 信号通路对HepG2 细胞增殖和凋亡的影响（， n＝5）

注：与对照组比较，∗P＜0.05。

表6 灵芝三萜通过Wnt／β-catenin 信号通路对HepG2 细胞增殖、凋亡的影响（， n＝5）

表6 灵芝三萜通过Wnt／β-catenin 信号通路对HepG2 细胞增殖、凋亡的影响（， n＝5）

注：与对照组比较，∗P＜0.05；与灵芝三萜+ddH2O 组比较，#P＜0.05。

Wnt 信号通路自20 世纪80 年代被发现以来，已成为细胞信号传导领域研究的热点，包括经典Wnt （Wnt／β-catenin） 信号通路和非经典信号通路，在细胞增殖、分化、凋亡等 过程中 起重要作用［21］。β-catenin 是Wnt／βcatenin 信号通路中的关键分子，Wnt 蛋白与卷曲蛋白（Fzd）、低密度脂蛋白受体相关蛋白5／6 或糖原合成酶激酶3β （GSK-3β） 等跨膜受体结合，将Wnt 信号传递至胞质蛋白，使β-catenin 由细胞质转移至细胞核，与T 细胞转录因子／淋巴样增强因子等核内转录因子结合而激活c-myc、细胞周期蛋白D1 （cyclin D1）、半胱氨酸蛋白酶（caspase）等下游靶基因［22-24］。Wnt／β-catenin 信号通路与结直肠癌、胃癌等多种肿瘤发展有关。据报道，GSK-3β、β-catenin 在结直肠癌组织中异常表达，调节GSK-3β、β-catenin 表达水平可抑制细胞增殖和转移［25］；激活Wnt／β-catenin 信号通路则促进胃癌细胞的迁移和侵袭，与胃癌预后不良有关［26］。本研究，100 μg／mL 灵芝三萜能够上调HepG2 细胞中caspase-3、caspase-8 蛋白表达并下调c-myc、cyclinD1、β-catenin 和p-GSK-3β 蛋白表达，抑制细胞增殖并诱导凋亡。20 μmol／L XAV-939 干预能抑制HepG2 细胞增殖并促进凋亡，而20 mmol／L LiCl 干预则结果相反。使用20 mmol／L LiCl 干预能在一定程度上减弱灵芝三萜对HepG2细胞增殖的抑制和细胞凋亡的诱导作用。

综上所述，灵芝三萜能够抑制肝癌细胞增殖并诱导凋亡，其机制可能是通过Wnt／β-catenin 信号通路调节下游靶标c-myc、cyclinD1、caspase-3、caspase-8 表达，从而调节细胞周期和细胞凋亡。