抑制USP22表达对胶质瘤细胞顺铂耐药的影响

吕和力

神经胶质瘤是大脑中最常见的原发性肿瘤，占所有恶性脑肿瘤的80%[1]。化疗是胶质瘤重要的辅助治疗手段之一，但是由于肿瘤存在异质性的问题，病人对化疗药物的敏感性有很大差异，从而影响了治疗效果。顺铂是胶质瘤化疗的重要药物之一，因此探讨胶质瘤的顺铂耐药分子特征，对开发胶质瘤个体化化疗具有参考意义。泛素特异性肽酶22 (ubiquitin specific peptidase 22，USP22)是泛素水解酶家族一个较新的成员，被证实在多种恶性肿瘤的发生、发展和转移中扮演重要角色[2-3]。大量的研究发现USP22在多种肿瘤中表达增高，其异常高表达常预示肿瘤即出现转移或出现化疗耐药[4-5]。其中，李朝晖等[6]检测到USP22基因在胶质瘤细胞中高表达，并且证实USP22基因在胶质瘤细胞的增殖中发挥重要作用。王宛明等[7]发现抑制USP22表达可增加胰腺癌细胞对化疗药物吉西他滨的敏感性。但是，USP22 是否与胶质瘤耐药相关尚未有文献报道。本研究探讨在胶质瘤中USP22的表达是否参与其顺铂耐药，从而发掘胶质瘤顺铂耐药的潜在分子机制，为胶质瘤化疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人胶质瘤细胞株U251购自中科院上海细胞所。DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司。顺铂(cisplatin)购自美国Sigma公司。USP22单克隆抗体为美国Santa Cruz公司的产品。Lipofectamine 2000试剂、CCK-8试剂盒和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 诱导顺铂耐药胶质瘤细胞株 参照文献[8]，用顺铂剂量梯度爬升筛选方法将U251细胞体外培养10个月，建立顺铂耐受细胞株(U251/CP2)。采用CCK-8方法，测定细胞的顺铂半数抑制浓度(IC50)，鉴定所诱导的U251/CP2细胞株的耐药性。

1.2.2 构建USP22沉默表达的细胞株 利用Lipofectamine 2000将USP22-shRNA表达质粒与病毒包装混合质粒共转染至293T细胞，进行病毒包装。收集病毒液后分别感染U251和U251/CP2细胞，polybrene筛选稳定干扰USP22表达的细胞克隆。RT-PCR法检测细胞USP22 mRNA表达水平，鉴定沉默效果。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 转染24 h后，收集细胞。PBS洗涤2次，重悬于500 μL的Binding Buffer溶液中，细胞筛过筛，加入5 μL Annexin Ⅴ和 5 μL PI染色液后混匀，室温下孵育15 min，然后上样至流式细胞仪检测分析凋亡情况。

1.2.4 Western blotting检测USP22蛋白水平 提取细胞总蛋白质，BCA法检测蛋白浓度后取等量蛋白上样，10% SDS-PAG/E恒压电泳分离蛋白，然后恒流电转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，USP22一抗和GAPDH内参4 ℃孵育过夜，PBST洗膜后，二抗37 ℃孵育1 h，采用凝胶成像系统成像，利用图像分析软件进行分析。

1.2.5 CCK-8检测顺铂IC50取对数生长期的细胞消化后制备成细胞悬液，以2×104/mL密度接种于96孔板，每孔100 μL，贴壁过夜。不同分组设3个复孔，培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育3 h，酶标仪测定450 nm处的吸光度，绘制曲线，计算顺铂IC50。

1.3 统计学方法 采用t检验、单因素方差分析及q检验。

2 结果

2.1 顺铂耐药细胞株U251/CP2的建立 经历持续10个月的诱导，获得在顺铂(2 μg/mL)中生长良好的耐药细胞U251/CP2。与亲本细胞相比，U251/CP2形态略有变化，表现为胞体较小，轴突较短且未分叉(见图1)。CCK-8法检测亲本细胞U251和耐药细胞U251/CP2对顺铂的敏感性差异有统计学意义(P<0.01)，显示U251/CP2顺铂耐药；U251/CP2细胞无药培养2周后，IC50为(71.68±0.49) μg/mL，耐药性未见降低(P>0.05)，说明U251/CP2对顺铂稳定耐药(见表1)。

表1 耐药细胞U251/CP2的耐药性检测

q检验：与对照组U251比较**P<0.01

2.2 USP22沉默细胞株U251-shUSP22、U251/CP2-shUSP22的建立 RT-PCR检测U251组、U251/CP2组、U251-shUSP22组和U251/CP2-shUSP22组细胞中USP22 mRNA的相对表达量分别为0.80±0.10、0.29±0.02、0.12±0.05、0.18±0.05。与U251组相比，U251-shUSP22组的USP22 mRNA表达水平明显降低(t=10.49,P<0.01)；与U251/CP2组相比，U251/CP2-shUSP22组的USP22 mRNA表达水平也明显降低(t=3.44,P<0.05)，说明成功干扰USP22基因沉默表达(见图2)。

2.3 抑制USP22表达促进胶质瘤细胞凋亡 流式细胞仪检测U251组、U251-shUSP22组、U251/CP2组和U251/CP2-shUSP22组的细胞凋亡率分别为(4.13±0.59)%、(23.64±4.82)%、(7.65±0.73)% 和(19.36±5.49)%；与U251组相比，U251-shUSP22组细胞凋亡率明显升高(t=6.96，P<0.01)；与U251/CP2组相比，U251/CP2-shUSP22组的细胞凋亡率同样也明显升高(t=3.66，P<0.05)；提示抑制USP22的表达可以显著提高胶质瘤细胞的凋亡率(见图3)。

2.4 顺铂促进胶质瘤细胞中USP22蛋白的表达 Western blotting检测发现0 μg/mL、0.5 μg/mL、8 μg/mL顺铂短暂处理(24 h)后U251细胞内USP22蛋白相对表达量分别为0.21±0.02、0.30±0.01、0.64±0.01，U251/CP2细胞2 μg/mL顺铂短暂处理(24 h)后USP22蛋白相对表达量为0.43±0.02(见图4)。与对照U251(0 μg/mL)组相比，USP22蛋白表达水平在U251(0.5 μg/mL)组、U251(8 μg/mL)组和U251/CP2(2 μg/mL)组中均明显提高(t=9.70、40.35、14.60,P<0.01)。提示顺铂用药可影响胶质瘤细胞中USP22的表达。

2.5 USP22表达下调增强胶质瘤细胞对顺铂的敏感性 与对照细胞U251相比，U251-shUSP22中USP22的蛋白表达水平明显下调(t=6.83，P<0.01)(见图5)。同时，U251-shUSP22的顺铂IC50为(0.56±0.07) μg/mL，与U251的顺铂IC50 (1.23±0.13) μg/mL差异有统计学意义(t=7.70，P<0.01)。提示下调USP22表达可增强胶质瘤细胞对顺铂的敏感性。

2.6 USP22表达下调可部分逆转耐药细胞株对顺铂耐药 与对照细胞U251/CP2相比，U251/CP2-shUSP22中USP22蛋白表达水平显著下调(t=3.01，P<0.05)(见图6)。U251/CP2的顺铂IC50为(73.73±2.74) μg/mL，而U251/CP2-shUSP22的顺铂IC50下降至(51.25±1.09) μg/mL(P<0.01) (见表2)，提示USP22表达下调，可逆转耐药细胞株U251/CP2对顺铂的耐药。U251与U251/CP2-shUSP22的顺铂敏感性差异有统计学意义(P<0.01)，说明USP22表达下调可在一定程度上逆转U251/CP2对顺铂耐药，但并非完全逆转。

表2 CCK-8检测各组细胞的顺铂

q检验：与对照组U251比较**P<0.01

3 讨论

胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，恶性程度高，侵袭性强，易复发，治疗相当困难。目前临床常用的治疗胶质瘤推荐方案包括替莫唑胺(TMZ) 剂量密度方案、联合治疗方案、抗血管生成治疗等。替莫唑胺为常用抗肿瘤药物，可通过阻断DNA合成，发挥抗肿瘤作用，控制病情进展。但是，并非所有病人均对替莫唑胺敏感，比如，O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶高表达病人易对烷化剂类产生耐药性[9]。有学者[10]指出采用替莫唑胺与铂类药物联合治疗复发性恶性肿瘤效果更优，可有效改善病人临床症状，控制癌灶扩散，延长病人生存时间。

顺铂是临床上最常用的铂类药物，主要作用靶点就是DNA，通过在细胞内形成铂-DNA加合物抑制DNA的复制和转录，是临床治疗多种实体瘤的重要药物，也是对胶质瘤敏感性较高的药物之一[11-12]。以抑制DNA合成的抗肿瘤药物，同时会使细胞启动防止其自身凋亡的多种修复机制来修复损伤的DNA，比如激活各种DNA修复酶使受损伤的DNA尽量恢复其结构和功能，从而尽量维持其正常的结构和功能，从而降低了该药物的临床疗效，使得肿瘤对该药物产生耐药性[13]。

胶质瘤的化疗耐药机制十分复杂，涉及到多方面因素，比如肿瘤细胞内药物的积聚减少、药物作用靶点减少、凋亡与抗凋亡机制失衡、DNA修复机制及肿瘤干细胞等。TABATABAI等[14]从胶质瘤中分离出胶质瘤干细胞(glioma stem cell,GSC)并发现胶质瘤细胞和GSC均具有多药耐药现象，以GSC更为显著。无论在体内还是体外GSC基本处于休眠状态，停滞于细胞周期中的G0/G1期并且高表达ABCG2、MDR等耐药基因。GSC能特征性表达ABC转运体，能将多种化疗药物转运出细胞外，从而对化疗药物产生耐药性[15]。另外，胶质瘤的耐药性还可能与高表达的MGMT、抗凋亡蛋白和凋亡蛋白抑制因子有关。崔磊等[16]利用芯片-基因组杂交技术筛选胶质瘤细胞中与顺铂耐药相关分子标志物，发现与胶质瘤顺铂耐药有关的基因包括CFHR1、CFHR3和IL-7等。但是，USP22基因是否也参与了胶质瘤耐药尚未有研究报道。

USP22基因位于人类17号染色体，编码蛋白产物约66 000，是hSAGA(human Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase)复合物的一个亚单位,是一类去泛素化酶，主要通过去泛素化修饰来调控肿瘤细胞的生长分化、影响细胞周期、转录激活和信号转导等。同时，USP22作为一个肿瘤干细胞标记家族的成员，在细胞周期、DNA转录、肿瘤发生发展进程中发挥重要作用，USP22可能通过细胞周期G1/S转换参与肿瘤耐药[17]。

李朝晖研究团队[6,18]通过多项研究，明确了USP22在胶质瘤细胞中高表达，且验证了USP22通过调节细胞凋亡和细胞周期在胶质瘤细胞的增殖中发挥作用。吕磊等[19]的研究指出沉默USP22可逆转膀胱癌细胞T24对丝裂霉素化疗药的耐药。王宛明等[7]的研究则指出了抑制USP22可逆转胰腺癌细胞SW1990对吉西他滨化疗药的耐药。然而，关于USP22是否参与了胶质瘤细胞耐药目前尚无人研究。

本研究首次探讨USP22表达与胶质瘤细胞顺铂耐药的关系。首先，通过剂量梯度爬升诱导顺铂耐药胶质瘤细胞株U251/CP2，相对于亲本细胞株U251，U251/CP2对顺铂的敏感性显著下降，显示出顺铂耐受。此后，Western blotting检测其中USP22蛋白表达情况，发现在U251/CP2中USP22的表达显著高于U251，提示USP22可能参与了胶质瘤顺铂获得性耐药。因此，本文又采用小干扰RNA沉默U251、U251/CP2细胞的USP22表达，证实抑制USP22表达可降低U251对顺铂的抗药性并可在一定程度上逆转耐药细胞株对顺铂的耐药。

综上所述，本研究发现USP22的表达与胶质瘤U251细胞对顺铂的耐药有相关性，提示USP22可能是胶质瘤顺铂耐药的分子机制之一，为进一步研究胶质瘤顺铂耐药机制提供了新的方向。