曲美他嗪对慢性心力衰竭大鼠的心肾保护作用及其机制探究

曾显阁

(南阳市中心医院 心脏大血管外科，河南 南阳473009)

慢性心力衰竭(CHF)作为大多数心脏疾病的最终阶段，其发病机制复杂，常伴有肾、肺等器官功能异常[1]。有研究表明，CHF合并肾功能异常会加重患者的病情，致其住院率以及死亡率上升，从而导致患者心肾功能进一步恶化[2]。所以，保护患者肾功能是在治疗CHF的同时不可忽视的一项重要工作。曲美他嗪可以提高患者心肌细胞功能，其能够抑制脂肪酸氧化，阻止ATP水平下降，从而维持机体内环境的稳定[3]。本文旨在探讨曲美他嗪对慢性心力衰竭(CHF)大鼠的心肾保护作用及其机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料盐酸曲美他嗪片购于施维雅制药有限公司，国药准字H200554654；周龄雄性Wistar大鼠24只，体重210-250 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK(京)2017-0022；基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子-β(TGF-β)、辣根过氧化物酶(HRP)购于美国Abcam公司；苏木素染液、Masson染液试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司，其他试剂购于上海生工生物股份有限公司。

全自动生化仪购自美国贝克曼有限公司；石蜡切片机购于英国Shandon公司；多功能酶标仪购于瑞士Tecan公司；电泳、转膜系统、凝胶成像仪购于美国Bio-Rad公司。

1.2 CHF模型与分组将24只雄性Wistar大鼠随机分为对照组8只、造模组16只。造模组大鼠均注射1.5 ml/kg戊巴比妥钠(3%)进行麻醉，在腹部正中间切口分层打开腹部，在左肾上腹主动脉分离出之后结扎，最后分层关闭腹腔。手术以后连续3 d均给予造模组大鼠腹腔注射20万U青霉素。常规喂养4周以后，检测左心室舒张末压(LVEDP)，如果LVEDP≥15 mmHg即建模成功。在成功建立CHF模型后，将其随机分成模型组8只、实验组8只。给予实验组大鼠曲美他嗪10 mg/(kg·d)灌胃，给予模型组和对照组大鼠等量的生理盐水灌胃。3组大鼠均灌胃4周。

1.3 血流动力学检测对大鼠注射麻醉药物以后，将其仰卧于手术台上。于其颈部正中间的地方切口，在右侧颈总动脉分离以后，结扎远心端的颈总动脉，将近心端的颈总动脉用动脉夹夹住。然后在结扎处与动脉夹之间的动脉上剪一个小口，插入一根充满肝素盐水的导管。测量3组大鼠的LVEDP、左心室压力最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室压力最大下降速率(-dp/dtmax)。

1.4 肾功能指标血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)的检测在检测完血流动力学之后，于颈动脉处采血备用。利用全自动生化分析仪来测定3组大鼠的BUN、Scr水平。

1.5 心肌组织HE染色取适当体积的心肌组织，用4%甲醛溶液将其固定12 h，用石蜡包埋切片，脱蜡，室温下用苏木素染色，用水快速冲淋30-60 s，用1%盐酸溶液浸润1 s，用水冲洗1 min，室温下用伊红染色5-10 min，用水冲洗1 min。然后用梯度乙醇脱水，最后用二甲苯透明10 min，适量中性树胶封片。水肿比例=水肿细胞数/总细胞数。

1.6 肾组织Masson染色取适当肾组织，4%甲醛溶液将其固定12 h，用梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片，脱蜡，室温下用苏木素染色，水洗，加入Masson染液10 min，水洗，先后用1%冰醋酸溶液、2.5%磷钼酸溶液浸洗，最后使用苯胺蓝染液染色，0.2%冰醋酸溶液浸洗，乙醇脱水后用二甲苯透明封片。胶原纤维面积/视野面积的比值采用Image-Pro Plus 6.0软件分析计算。

1.7 MMP-2、MMP-9、α-SMA、TGF-β蛋白检测将剥离出的肾组织剪碎以后，分离蛋白且进行浓度检测。对蛋白进行变性、电泳，转膜，封闭，4℃孵育过夜，缓冲液洗膜之后，用0.02%的辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG，室温孵育1 h，洗膜之后用增强型化学法(ECL)显色，采用凝胶成像系统分析。

2 结果

2.1 3组大鼠LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax比较与对照组大鼠相比较，实验组大鼠的LVEDP明显升高，+dp/dtmax、-dp/dtmax明显降低(均P<0.05)；与模型组大鼠相比较，实验组大鼠的LVEDP明显降低，+dp/dtmax、-dp/dtmax明显升高(均P<0.05)，见表1。

2.2 3组大鼠BUN、Scr水平比较与对照组大鼠相比较，实验组大鼠的BUN、Scr明显升高(均P<0.05)；与模型组大鼠相比较，实验组大鼠的BUN、Scr明显降低(均P<0.05)，见表2。

表1 3组大鼠LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax比较

注：与模型组比较，*P<0.05；与对照组，#P<0.05

2.3 3组大鼠心肌组织HE染色与对照组大鼠比较，模型组大鼠水肿比例明显增大，心肌纤维排列明显紊乱，细胞横径显著增大、水肿(P<0.05)；与模型组大鼠比较，实验组大鼠水肿比例明显减小，心肌纤维排列比较整齐，细胞肿胀程度明显减轻(P<0.05)，见图1，表3。

表2 3组大鼠BUN、Scr水平比较

注：与模型组比较，*P<0.05；与对照组，#P<0.05

图1 3组大鼠心肌组织HE染色(HE×400)

2.4 3组大鼠肾组织Masson染色与对照组大鼠比较，模型组大鼠肾组织胶原纤维面积/视野面积的比值增大，肾小球毛细血管处胶原纤维增生明显增加(P<0.05)；与模型组大鼠比较，实验组大鼠肾组织胶原纤维面积/视野面积的比值明显减小，肾小球毛细血管处胶原纤维增生明显减少(P<0.05)，见图2，表3。

图2 3组大鼠肾组织Masson染色(Masson×200)

表3 3组大鼠心肌HE染色水肿比例、肾组织Masson染色视野面积比较

注：与模型组比较，*P<0.05；与对照组，#P<0.05

2.5 3组大鼠肾组织MMP-2、MMP-9、α-SMA、TGF-β蛋白相对表达量比较与对照组大鼠相比较，实验组大鼠MMP-2、MMP-9、α-SMA、TGF-β蛋白相对表达量明显升高(均P<0.05)；与模型组大鼠相比较，实验组大鼠MMP-2、MMP-9、α-SMA、TGF-β蛋白相对表达量明显降低(均P<0.05)，见图3，表4。

表4 3组大鼠肾组织MMP-2和MMP-9蛋白相对表达量比较

注：与模型组比较，*P<0.05；与对照组，#P<0.05

3 讨论

目前，CHF在我国的发病率以及死亡率每年都在持续上升，其是由有多种病因共同作用导致的，而且CHF患者经常会伴随出现肾衰竭的症状[4]。由CHF引起的肾衰竭称之为心肾综合征，是CHF的终末阶段。近些年来，随着社会老龄化的加剧慢性心血管疾病的发病率也在逐年上升，且经常有肾衰竭的现象出现。为了阻止心力衰竭与心肾综合征的出现，阻断神经内分泌系统激活与心室重塑是非常有必要的[5]。曲美他嗪可以保护心肌细胞功能，经常用于心脏的研究中。有研究报道，曲美他嗪可以改善大鼠心力衰竭模型神经激素的分泌，保护心肾功能[6]。

图3 3组大鼠肾组织MMP-2、MMP-9、α-SMA、TGF-β蛋白相对表达量

本文研究结果显示，与对照组大鼠相比较，模型组大鼠的LVEDP明显升高，+dp/dtmax、-dp/dtmax明显降低(均P<0.05)，这说明大鼠舒张功能与心脏收缩在术后都有明显下降，表示CHF模型建立成功。与模型组大鼠相比较，实验组大鼠的LVEDP明显降低，+dp/dtmax、-dp/dtmax明显升高(均P<0.05)，与对照组大鼠相比较，实验组大鼠的BUN、Scr明显升高(均P<0.05)；与模型组大鼠相比较，实验组大鼠的BUN、Scr明显降低(均P<0.05)，这说明曲美他嗪具有保护心肾功能的作用。为了验证这一结果，通过HE染色对3组大鼠心肌组织进行病理学分析发现，与模型组大鼠比较，实验组大鼠水肿比例明显减小，心肌纤维排列比较整齐，细胞肿胀程度明显减轻(P<0.05)。与张红等人文献报道的结果一致[7]。

CHF会引发患者出现肾小管间质纤维化，其是所有慢性肾脏疾病的最终阶段[8]。肾小管间质纤维化的主要特点是细胞外基质(ECM)会过度沉积在肾间质中[9]。Ⅳ型胶原作为肾小球基底膜的重要组成成分，能够被金属蛋白酶(MMPs)家族的两个关键成员MMP-2、MMP-9调节降解，MMP-2、MMP-9可以通过调节Ⅳ型胶原的降解来调节生理状态和病理状态下肾脏ECM的代谢平衡[10]。α-SMA作为一种特异性蛋白，可以用来标记肾小管间质纤维化[11]。TGF-β能够通过介导肾间质发生纤维化与肾小球出现硬化来直接调控肾小球的损伤过程[12]。肾小管上皮细胞在受到刺激以后，会分化成肌成纤维细胞，通过增加结缔组织生长因子和TGF-β的水平而出现肾纤维化[13]。本文研究结果显示，实验组大鼠MMP-2、MMP-9、α-SMA、TGF-β蛋白相对表达量明显降低(均P<0.05)，可以进一步说明曲美他嗪能够改善CHF大鼠肾脏纤维化的程度。为了验证这一结果，通过Masson染色对3组大鼠肾组织进行病理学分析发现，与模型组大鼠比较，实验组大鼠肾组织胶原纤维面积/视野面积的比值明显减小，肾小球毛细血管处胶原纤维增生明显减少(P<0.05)。这一结果与谭淑娜等人的结果吻合[14]。

综上所述，曲美他嗪可以明显保护CHF大鼠的心肾功能，能够改善心肾组织结构。