microRNA-31联合CEA对肺癌早期诊断的临床意义

赵宝祥,李 华,张亚君,王雪辉,尹志永

(秦皇岛市第二医院 检验科，河北 秦皇岛066000)

目前，肺癌依然是全球发病率、病死率最高的恶性肿瘤之一，而且由于环境等因素的影响，其发病率一直呈现逐年上升的趋势[1]。这同时也给社会带来了高额的治疗费用。然而大多数肺癌在就诊时已经处于病情的中晚期，延误了治疗的最佳时间，给治疗带来了很大的困难。因此，早期诊断、早期治疗依然是提高肺癌疗效的重要方法。

癌胚抗原(Carcino-embryonic antigen CEA)是一种从结肠癌和胎儿肠组织中发现的蛋白。现在已经证实其与包括肺癌在内的多种肿瘤的发生发展具有相关性，能够用来做为诊断多种肿瘤的标记物[2]。但由于肺癌的发生发展与多种因素相关，单一的诊断指标存在一定的局限性，包括特异性不强，灵敏度不高等缺点，并不能够很好的对早期肺癌做出诊断，因此联合指标诊断受到了人们越来越多的关注[3]。

1993年研究者发现了一种非编码单链小分子RNA，大约由18-23个碱基组成，将其命名为microRNA。microRNA被证实参与了多种肿瘤的进展，能够被用来做为肿瘤诊断的标记物[4]。其中microRNA-31在肺癌患者中被检测出高表达，其能够导致肺部组织增生，最终发展为肺癌。这表明microRNA-31有望成为肺癌诊断及治疗的一个新的靶标[5]。为此，本研究对肺癌患者进行了CEA单独、microRNA31单独及CEA联合microRNA-31检测，期望寻找到一种更加准确地肺癌诊断方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取365例于2016年1月至2018年2月我院就诊患者。其中186例确诊为肺癌患者，其中男94例，女92例，年龄45-76岁，设为肺癌组。纳入标准：经病理、免疫组化检测，同时结合影像学指标确诊为肺癌，同时暂未接受治疗者。肺良性病变组患者108例，其中男56例，女52例，年龄43-70岁，经病理、免疫组化检测，同时结合影像学指标排除肺癌，设为肺良性病变组；另有健康体检者71例，其中男40例，女31例，年龄46-73岁，设为健康对照组。

1.2 方法

1.2.1CEA含量测定 3组研究对象均采集空腹静脉血3 ml，置于含促凝剂的真空采集管，分离血清。血清中CEA检测采用双抗体夹心法 ，试剂盒购自艾康生物技术(杭州)有限公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.2microRNA-31检测 取已经分离好的血清500 μl，应用RNA提取化试剂盒(QIAGEN公司，德国)，具体根据产品说明书进行操作程。RNA浓度及纯度使用微量分光光度计进行测定，之后按照Promega 逆转录系统说明书进行逆转录。microRNA测定使用荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR ，qRT-PCR)仪ABI7500进行，引物序列见表1。microRNA的表达水平应用阈值循环(Threshold Cycle ，Ct)表示，microRNA-U6做为内参计算2-ΔCt值，ΔCT=CTmicroRNA-31—CT microRNA-U6。每分样品均做3复孔，并计算平均值。

表1 实时定量PCR引物

2 结果

2.1 3组研究对象血清中CEA检测结果比较首先，我们检测了3组患者血清中CEA的含量，结果显示，相比健康组及良性病变组，肺癌患者血清中CEA的含量明显增高。另外，良性病变组患者血清中CEA含量高于健康组(P<0.05)，显著高于肺良性病变组和健康对照组(P<0.05)，见表2。

表2 不同人群血清中CEA含量比较

注：*代表与健康组相比P<0.05，#代表与肺良性病变组相比P<0.05。

2.2 3组研究对象血清中microRNA-31检测结果比较为了验证3组人群中microRNA-31表达的差异，我们接下来通过qRT-PCR的方式检测了三组患者血清中microRNA-31的。结果显示，相比健康组及良性病变组，肺癌患者血清中microRNA-31表达显著增加(P<0.05)。同时，良性病变组患者血清中microRNA-31表达要高于健康组(P<0.05)，见表3。

表3 不同人群血清中microRNA-31表达水平比较

注：*代表与健康组相比P<0.05，#代表与肺良性病变组相比P<0.05。

2.3 CEA联合microRNA-31检测与单独CEA、microRNA-31 检测对肺癌的诊断比较最后，为了检测CEA 与microRNA-31联合检测对于肺癌的诊断效能的提高，我们从灵敏度、特异性、阳性预测率及阴性预测率四方面对联合检测与单独检测进行了比较。结果显示， CEA单独或者microRNA-31单独检测对于肺癌诊断而言在灵敏度、特异性及阴性预测率四方面并没有太大差异(P>0.05)，而CEA单独检测在阳性预测率上要优于microRNA-31单独检测。CEA联合microRNA-31检测显著提高了肺癌诊断的灵敏度、阴性预测率及阳性预测率，均具有统计学意义(P<0.05)。

表4 CEA联合microRNA-31检测与单独检测对肺癌诊断的效能比较

注：*代表与CEA单独检测相比P<0.05，#代表与microRNA-31单独检测相比P<0.05。

3 讨论

肺癌是世界范围内发病率及死亡率最高的恶性肿瘤。近年来，由于环境因素等因素的影响，其发生率正在逐年上升，而且5年存活率只有15%[6]。早期诊断、早期治疗是改善肺癌患者的康复率及预后的有效方法。而寻找早期诊断和预后评估的标记物是提高其诊断率的关键。由于影响肺癌发生的因素很多，单一的指标来诊断肺癌往往效果不佳，因此学者们尝试使用两种甚至两种以上的指标来进行诊断，以期提高肺癌的诊断效果。

CEA是一种从小肠腺癌及胚胎的结肠粘膜中分离出来的蛋白。最初被人们是一种消化系统特异性的肿瘤抗原。但是现在已经证明CEA同样可以作为诊断肺癌的肿瘤标志物。但是，血清中CEA的水平作为生物标志物诊断肺癌的特异性和灵敏性相对较低，主要被用于手术切除后的复发鉴定以及治疗期间的治疗效果判定[7]。在该实验中，为了提高CEA水平在肺癌诊断中的作用，我们尝试了CEA与microRNA-31联合检测对肺癌诊断的灵敏度、特异性、阴性预测率及阳性预测率的作用。我们发现，CEA与microRNA-31联合检测能够显著提高肺癌诊断的灵敏度、阴性预测率及阳性预测率，对提高临床上肺癌的诊断效能具有一定的帮助。

microRNA是内生的非编码RNA，在基因调控中起到非常重要的作用。随着microRNA表达谱的不断扩大[8]，人们对microRNA与肿瘤的发生发展的关系进行了广泛的研究。microRNA-31作为一种首次在hela细胞中被鉴定的microRNA[9]，已经被证实与包括肺癌在内的多种人类肿瘤有关[10]。microRNA在血浆和血清中非常稳定，有利于表达水平的检测。microRNA-31不仅在肺癌组织中有较高的表达，而且外周血中的表达水平也显著增加。研究表明，肺癌患者外周血microRNA-31表达水平明显高于健康成年人。同时，生存分析表明，microRNA-31低表达组的中位生存期长于microRNA-31高表达组，提示microRNA-31表达水平在外周血液中具有良好的诊断价值，可用于肺癌患者的诊断及评价患者预后[11]。我们的研究同样揭示了这一点。我们通过检测肺癌患者、肺部良性病变患者以及健康体检者血清中CEA及microRNA-31的水平，发现联合诊断能够有效地提升肺癌患者的诊断效能，具有极高的临床应用价值。

然而，越来越多的证据表明，不同肿瘤类型的microRNA-31水平各不相同，microRNA-31的作用功能尚需进一步研究[12]。随着对microRNA的不断研究进展，microRNA作为临床上肿瘤的诊断指标将会得到越来越多的关注。