玉米干全酒精糟氨基酸的近红外检测研究

樊 霞 姜训鹏 贾 铮 肖志明 李 兰 李 阳 刘晓露

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 国家饲料质量监督检验中心（北京），北京100081；2.中粮饲料有限公司，北京100020）

来源于乙醇工业副产物的玉米干全酒精糟（即Distillers's Dried Grains with Solubles，简称DDGS）是一种重要的蛋白质饲料原料，每年国内饲料消耗量可达300 万吨以上。确定氨基酸组成含量是判定蛋白饲料原料质量的重要环节，但国内外乙醇生产设备和工艺类型存在较大差异，导致不同来源和批次玉米DDGS 中氨基酸含量的差异较大[1-2]。快速测定玉米DDGS氨基酸含量成为饲料和养殖行业在高效利用玉米DDGS中的迫切需求。

众多氨基酸含量测定方法中，高效液相色谱方法、离子交换色谱法、毛细管电泳法多作为氨基酸同步测定的标准方法和仲裁方法，虽然方法准确性高、重复性好，但使用的仪器昂贵、检测耗时长、对检测人员的专业能力要求高。回归方程法是基于常规成分（粗蛋白、粗纤维、粗灰分和干物质等）与氨基酸含量的相关关系，建立了一元或多元的回归预测方程，用于获取氨基酸含量，此种间接方法快速、仪器常规，但预测误差较大[3]。近红外光谱法（Near Infrared Spectroscopy，NIRS）利用含氢基团的有机物质在近红外谱区的分子振动吸收，测定样品中多种化学成分的一项高通量分析技术，具有非破坏性、绿色环保和分析速度快等优点。NIRS 是一种经验方法，为实现精准的检测分析，需要研究构建具有广泛代表性的定量分析模型。近些年来，大量学者和机构组织都在构建氨基酸定量分析模型上进行了巨大投入[4-5]。鱼粉[6]、大豆粕[7]、菜籽粕[8]、动物源性副产物[9-10]、油菜籽饼粕[10-11]、玉米[12]、小麦[13]、高粱[10]、米糠[10]、玉米蛋白粉[10]等饲料原料和成品[14]已见诸多报道，但尚未见玉米DDGS 的氨基酸定量分析模型构建研究。本文采集国内外不同工艺、不同年份和不同产地的具有代表性的玉米DDGS 样品，利用国家标准方法测定氨基酸含量，借助光栅型近红外光谱仪采集近红外漫反射光谱，构建了18 种氨基酸的定量分析模型，为玉米DDGS 中氨基酸含量的快速获取提供了一种高效、可靠的分析方法。

1 材料与方法

1.1 代表性样品采集与预处理

广泛采集来源于美国及国内（辽宁、吉林、黑龙江、山东、安徽、四川和甘肃等省份）、不同等级具有代表性的玉米DDGS样品，共110份。其中，低脂型玉米DDGS 共11 个，包含5 个一级，6 个二级；高脂型玉米DDGS共99个，其中28个一级，71个二级。

所有样品均密封包装，存贮于4 ℃的恒温药品冷藏箱中。试验开始前，取出样品，放至室温。采用四分法分为2份，装入自封袋中，置于干燥阴凉处保存，一份用于18 种氨基酸参考值的获取，一份用于近红外光谱的扫描。在近红外光谱扫描之前，样品需经德国Retsch 公司ZM200 型旋风磨粉碎处理，并过40 目试验筛。

1.2 参考值的获取

18 种氨基酸含量的测定按照国家标准方法《饲料中氨基酸的测定》（GB/T 18246—2000）、《饲料中含硫氨基酸的测定 离子交换色谱法》（GB/T 15399—2018）和《饲料中色氨酸的测定》（GB/T 15400—2018）进行。18 种氨基酸分别为天冬氨酸（Asp）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）、蛋氨酸（Met）、胱氨酸（Cys）和色氨酸（Trp）。每个样品平行分析2 次，取平均值作为近红外模型构建的参考值。

1.3 近红外光谱的扫描

利用丹麦FOSS公司的DS2500F光栅型近红外光谱仪采集样品的近红外漫反射光谱，检测器为硅（850～1 100 nm）和硫化铅（1 100～2 500 nm），单台仪器的波长精确度＜0.005 nm，多台仪器间波长精确度＜0.02 nm。光谱扫描参数设置为：光谱扫描范围850～1 099 nm和1 100～2 499 nm，光谱分辨率0.5 nm,采样数据点3 300个，扫描速度约60 s/次。样品重复装样扫描2 次，取2 次扫描光谱的平均值作为样本的原始光谱。

1.4 近红外定标模型的建立与验证

采用Kenard-Stone（KS）法[15]，以样品间欧式距离为划分依据，按3∶1的数目比例，分为校正集和验证集，并保障验证集样品参考值均在校正集样品参考值的范围内。所选出的校正样本能够均匀地覆盖整个样本集的实验区域。

为消除样品均匀度、样品粒度、基线漂移和偏移、随机噪音及周围环境等非目标因素对近红外光谱造成的干扰，采用了导数处理、变量标准化、多元去散射校正等单一或组合方法预处理光谱。选择偏最小二乘回归法（Partial Least Squares Regression，PLS），在全波长范围内，构建不同氨基酸的定量分析模型。根据交互验证均方差最小（RMSECV）的方法确定偏最小二乘方法的建模潜变量数（Latent Variables，LVs）。衡量模型定标效果的参数为：校正集、全交互验证集、验证集的决定系数和均方差，分别用R2C、R2CV、R2P、RMSEC、RMSECV、RMSEP 缩写表示。为预测模型的实际应用效果，选用验证集的相对分析误差RPD[16]作为参考指标。所有的数据处理均在Matlab 7.0 软件（The Math-Works, 美国）配合PLS_toolbox 6.7（Eigenvector research, 美国）工具包中实现。

2 结果与讨论

2.1 玉米DDGS的18种氨基酸含量统计分析(见表1、图1)

表1 样本集与参考数据库中玉米DDGS氨基酸含量的对比(%)

图1 玉米DDGS 18种氨基酸含量的箱线图

玉米DDGS 18 种氨基酸含量的统计箱线图如图1 所示。谷氨酸、亮氨酸和脯氨酸的含量相对较高，中位值分别为4.60%、3.13%和2.22%。蛋氨酸、胱氨酸和色氨酸含量相对较低，中位值分别为0.62%，0.49%和0.16%。18 种氨基酸的变异系数在6%～22%，均高于5%，且赖氨酸的变异系数最高为22%，与相关研究报道也一致[17]。玉米DDGS 由干酒精糟（Distillers Dried Grains，DDG）及可溶性酒精糟滤液（Distillers Dried Souble，DDS）组成。DDG 是玉米发酵提取酒精后的固态剩余物，主要包括蛋白、纤维、脂肪等；DDS 是可溶性酒精糟滤液，包括如发酵中产生的酵母、糖化物和未知的生长因子等可溶性营养物质。这两种成分组成差异很大，且不同工艺、不同批次下组成比例变化大，显著影响着玉米DDGS 中氨基酸的组成。

表1 为样本集与参考数据库中高、低脂玉米DDGS 氨基酸含量的对比。样本集中包含了110 份玉米DDGS 样品，其中，低脂型和高脂型玉米DDGS，分别为11 个和99 个。表中样本集数据为各类型玉米DDGS 不同氨基酸含量的中位值。参考数据库分别为美国NRC2012[18]、法国饲料成分表INRA2004[19]和中国饲料成分与营养价值表CFIC2018[20]。本样本集和美国NRC 的数据均表明高低脂玉米DDGS 在氨基酸含量组成上具有差异，例如，谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸4 种氨基酸在低脂玉米DDGS 中的含量相对于其在高脂玉米DDGS的含量更高。可见，在构建玉米DDGS的氨基酸近红外定量分析模型中，需要获取不同脂肪含量的玉米DDGS样品，以增强样本集的代表性。

2.2 玉米DDGS的近红外特征光谱（见图2）

玉米DDGS在近红外谱区有明显吸收峰，该区域光谱主要为C-H、N-H、O-H等键的倍频及合频吸收，如图2所示。波长1 450 nm和1 923～1 940 nm为水分O-H拉伸和H-O-H弯曲合频的吸收谱带。2 100 nm与淀粉中C-H基团的伸缩和转动吸收有关。2 050 nm与2 180 nm处与蛋白或酰胺中N-H面内弯曲和C-N拉伸的合频振动等密切相关。2 000～2 200 nm 谱区的谱图形状反映其蛋白与淀粉的相对含量上的差异性。高蛋白含量的饲料原料在2 050 nm 和2 180 nm处具有双吸收峰[21]，在2 100 nm 淀粉吸收峰处为波谷；高淀粉含量饲料原料（如玉米）仅有2 100 nm淀粉吸收峰，并蛋白吸收峰被重叠。对比玉米DDGS的近红外光谱，也可见因淀粉被提出，其2 100 nm 吸收峰明显变弱。

2.3 18种氨基酸的近红外定量分析模型(见表2)

表2 为玉米DDGS 中18 种氨基酸的最优近红外模型。从表2中可以看出：不同氨基酸的预测效果存在较大差异，例如天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、蛋氨酸、胱氨酸和色氨酸10种氨基酸定量分析模型校正集的决定系数在0.85～0.95，苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸和脯氨酸7 种氨基酸定量分析模型的决定系数在0.73～0.82，而赖氨酸定量分析模型的决定系数为0.62。其他饲料原料不同氨基酸的近红外定量分析模型的预测效果也具有较大差异[6-8]，例如，鱼粉中酪氨酸相对于鱼粉中其他氨基酸更不易被NIRS 分析[6]。评价近红外定量分析模型的精准度取决于评估参数的合理选取。根据不同的研究和应用目的，不同的模型评估参数会被用于评价近红外模型。R2反映了参考值与分析结果的相关性，间接反映了不同氨基酸与近红外特征谱峰的相关性，其值越接近1，相关性越高，预测能力越高。RMSEC、RMSECV 和RMSEP 分别代表校正集、交互验证集和预测集的残差的均方差。一般来说，R2C（或R2P）越接近1，RMSEC（或RMSECV、RMSEP）越小，表明模型的校正和预测精准度越高，而小的RMSEC（或RMSECV、RMSEP）比大的决定系数更为重要[22]。18 种氨基酸模型的RMSEP 均在0.03～0.19，且仅谷氨酸和亮氨酸2 种氨基酸的RMSEP＞0.10，其余氨基酸均≤0.10，可见本研究模型能够实现玉米DDGS 中多种氨基酸含量的快速获取。

3 结语

氨基酸是构成生命体的重要营养物质，也是决定饲料和畜牧行业高效利用玉米DDGS 的重要因素。本文采集国内外不同工艺、不同年份和不同产地的具有代表性的110份玉米DDGS样品，构建了玉米DDGS的18 种氨基酸的近红外定量分析模型，模型RMSEP均在0.03～0.19，可实现玉米DDGS中多种氨基酸含量的快速获取。