肾透明细胞癌患者外周血中微小RNA-223的表达及临床意义

陈明成,贾洪涛

(1.锦州医科大学湖北医药学院研究生培养基地,湖北 十堰,442000;2.湖北医药学院附属人民医院 泌尿外科,湖北 十堰,442000)

约90%的肾恶性肿瘤是肾细胞癌(RCC)。RCC转移潜力高,10%～20%的病例在诊断时出现转移,20%～30%在术后随访期间发生转移[1]。透明细胞RCC(ccRCC)是最常见的组织学亚型[2]。随着靶向疗法的改进，转移性ccRCC患者预后明显改善，但仍有多数患者出现耐药性[3]。研究[4]表明，微小RNA(miRNA)是脊椎动物蛋白质编码基因表达的主要调节器，是生长、免疫反应、组织发育和维持组织特定功能等基本生物过程的关键调节器。研究[5]发现,miRNA平均半衰期为119 h(约5 d)。研究[6-7]表明，循环miRNA或可用于检测各种不同类型的癌症，并指导治疗干预[7]。牛少曦等[8]研究表明,miR-223与ccRCC的增殖及迁移可能有相关性。多项研究[9-11]表明,miR-223在急性脑梗死、强直性脊柱炎、胃恶性肿瘤患者外周血中表达异常。本研究探讨血浆miR-223在ccRCC患者外周血中的表达及其临床意义，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年8月—2019年7月十堰市人民医院40例诊断为ccRCC患者的术前及术后7 d(miRNA半衰期约为119 h)外周血浆标本设为实验组，其中女14例，男26例;年龄54～76岁;TNM分期包括Ⅰ期6例,Ⅱ期13例,Ⅲ期14例,Ⅳ期7例。选取2017年8月—2019年7月十堰市人民医院门诊体检的80例健康志愿者外周血液标本设为对照组，其中男50例，女30例，年龄50～70岁。2组均抽取静脉无菌血样，经过静置离心后取上清，保存于-80 ℃冰箱中。标本获取得到受试者本人知情同意，本院伦理审查委员会已审查通过。

1.2 方法

1.2.1 提取血样总RNA进行cDNA逆转录:首先从-80 ℃冰箱中抽取实验所需的血样，根据RNA提取试剂盒的说明，使用Qiagen RNeasy lipid mini kit试剂盒提取血液样品中的总RNA,采用紫外分光光度法测定提取物的纯度和浓度。分别加入M-MLV逆转录酶、逆转录反应缓冲液、RNA 酶抑制剂、逆转录特异引物，使用Taqman miRNA试剂盒逆转录cDNA。逆转录特异引物序列为:CTCACAGTACGTTGGTATCCTTGTGATGTT

TCGATGCCATATTGTACTGTGAGTGGGGTAT。反应条件依次为16 ℃下30 min,40 ℃下30 min,80 ℃下6 min。

1.2.2 实时定量PCR检测血样miR-223表达量:按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书，使用ABI7500 PCR 仪进行荧光定量检测，以u6作为对照，对样品中的miR-223的相对表达水平进行测定。u6引物序列为:上游引物5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;下游引物5′-AAGGAAGCGCTGGATG-3′。反应条件依次为95 ℃变性60 s,55 ℃变性10 s,55 ℃变性10 s。应用实验所得的CT值得出ccRCC患者术前血浆、ccRCC患者术后血浆、健康人群外周血浆中miR-223的相对表达量。

1.3 统计学分析

数据经SPSS统计软件分析处理。miR-223相对水平以均数±标准差表示，比较行t检验。采用Spearman法分析miR-223在外周血中的表达与临床病理特征的关系。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价外周血中的miR-223表达水平诊断ccRCC的价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2组外周血浆中miR-223的表达

利用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)测得2组外周血浆中miR-223的表达量,ccRCC患者术前外周血中miR-223的表达量为(0.568±0.047),高于健康人群的(0.231±0.037),差异有统计学意义(P<0.05);ccRCC患者术后7 d外周血中miR-223的表达量为(0.324±0.041),较术前外周血中miR-223表达量降低，但仍高于健康人群，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 ccRCC患者外周血中miR-223的表达与临床病例特征的关系

结果显示,miR-223在外周血中的表达与肿瘤TNM分期、肿瘤大小、肿瘤分化程度有显著相关性(P<0.05),与年龄、性别、有无淋巴结转移无显著相关性(P>0.05)。见表1。

表1 ccRCC患者外周血中miR-223的表达与临床病理特征的关系

与同一指标另一亚项比较,*P<0.05。

2.3 外周血中miR-223的表达诊断ccRCC的临床价值

外周血中miR-223的表达在区分ccRCC患者和健康人群中具有较高诊断价值，其ROC曲线下面积为0.893,对ccRCC的诊断具有较高的敏感度和特异度。见图1。

图1 miR-223诊断ccRCC的ROC曲线分析

3 讨 论

研究[12]发现,ccRCC在肾脏近端小管中发展，与冯希佩尔-林道(VHL)肿瘤抑制基因的双发失活有关。VHL综合征是由VHL基因的生殖系点突变引起的遗传性疾病，其特征是各种良性和恶性肿瘤的易感性。根据患者的基因型,VHL综合征可分为4个亚型(1、2A、2B和2C),只有1和2B亚型患者易患ccRCC。

研究认为,miRNA与癌症形成和进展高度相关,miRNA通过在特异性mRNA的3′未翻译区域内进行互补配对来发挥生物功能，这通常通过mRNA降解或转化抑制的方式导致靶基因表达的降低。研究[13]表明,miRNA在正常组织和癌症组织之间表达不同，并且这种表达在不同的癌症类型之间也存在差异。研究[14]证实，循环miRNA或可用于检测各种不同类型的癌症，并指导治疗干预。研究[15-17]表明,miR-223在多种人类癌症中具有上调作用，包括结肠直肠癌、肺癌和胃癌。本研究发现,ccRCC患者术前外周血中miR-223的表达量显著高于健康人群，患者术后7 d外周血中miR-223的表达量仍高于健康人群，但较术前已显著降低;同时,miR-223在外周血中的表达与肿瘤TNM分期、肿瘤大小、肿瘤分化程度有显著相关性(P<0.05),与年龄、性别、有无淋巴结转移无显著相关性(P>0.05)。本研究还显示,miR-223的ROC曲线下面积为0.964,提示外周血中miR-223的表达在区分ccRCC患者和健康人群中具有较高诊断价值，对ccRCC的诊断具有较高的敏感度和特异度。

综上所述,miR-223或可成为诊断ccRCC的血清生物学标志之一，且与肿瘤的临床病理特征有一定相关性，对患者术后的复查及预后判断亦有一定的价值。