急性高眼压小鼠视网膜中窖蛋白-1(Cav-1)的表达△

任玉玲 张晓帆 孔蕾 唐仲书 张利伟

青光眼是以进行性眼部视神经病变，及伴随的不可逆性视功能丧失为特征的一类疾病，发病机制目前尚未明确[1]。2010年，Thorleifsson等[2]研究发现了窖蛋白(Caveolin，Cav)-1/2与原发性开角型青光眼可能有联系，但Cav-1/2位点与原发性开角型青光眼如何相关尚未完全清楚。目前，Cav-1对青光眼的作用研究主要集中在其对房水引流通道及房水动力学的影响上[3-6]。那么，Cav-1是否只通过这一途径影响青光眼的病理生理过程？研究发现，Cav-1广泛分布于视网膜血管细胞[7]、Müller细胞[8]、视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells，RPE)[9]以及光感受器细胞[10]。结合Cav-1在视网膜中的表达分布及功能，我们认为，Cav-1可能参与了青光眼中视网膜损伤的病理过程。为验证这一观点，本研究拟建立急性高眼压(acute ocular hypertension,AOH)小鼠模型，通过不同方法检测Cav-1 的表达变化，初步明确Cav-1是否参与AOH视网膜损伤的病理过程。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组选择6～8周龄的C57野生型雌性小鼠75只，体质量18～22 g，实验前检查双眼前节和眼底均正常。实验动物由中山大学中山眼科中心动物科提供，实验动物及实验使用条件均符合《实验动物管理条例》。小鼠随机分为两组：实验组60只，通过前房灌注法建立AOH模型；对照组15只，不做任何处理。

1.2 主要试剂及仪器抗Cav-1抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；抗GAPDH抗体、辣根过氧化物酶羊抗兔抗体、多聚甲醛(美国Sigma公司)；羊抗兔荧光二抗、驴血清(美国Millipore)；TRIzol(美国Life); PrimeScript RT reagent Kit(日本TAKARA)；SYBR®Green Master Mix(美国Roche)。蛋白电泳系统(美国Bio-Rad)；激光共焦显微镜LSM710(德国Zeiss公司)。

1.3 动物模型建立及标准实验组小鼠随机选取一眼建立AOH模型。具体方法为：小鼠腹腔内注射43 g·L-1水合氯醛(0.01 mL·g-1)全身麻醉，使用复方托吡卡胺滴眼液散大瞳孔；将连接生理盐水瓶的30 G针头插入术眼前房，缓慢调节生理盐水瓶高度至150 cm，使眼压约110 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg),此时可见角巩膜缘血管苍白，视网膜血管苍白，表示视网膜缺血成功；持续60 min后，拔出前房灌注针头，恢复视网膜血供,此时可见角巩膜缘血管恢复血供，视网膜血管恢复血供，表示再灌注成功[11]。对侧眼不做任何处理。

1.4 荧光定量PCR(Q-PCR)检测小鼠过量麻醉处死，收取对照组及AOH模型建立后1 d、2 d、3 d、7 d实验组小鼠眼球，各5只小鼠5眼，置于冰上迅速分离出视网膜。使用TRNzol试剂抽提总RNA,分离纯化后使用紫外分光光度计法定量。行逆转录反应合成cDNA，以其为模板进行Q-PCR检测。反应条件详见文献[11]。检测Cav-1 mRNA表达变化，引物序列为：β-actin上游引物为5’-GGCACCAGGGCGTGATGG-3’，下游引物为3’-GTCTCAAACATGATCTGGGTC-5’； Cav-1上游引物为5’-TGGAGTCACAGAAGGAGTGGCT-3’，下游引物为3’-GACCACAGTGAGGAATGTCCAC-5’。

1.5 Western blot检测小鼠过量麻醉处死，收取对照组及AOH模型建立后1 d、2 d、3 d、7 d实验组小鼠眼球，各5只小鼠5眼，置于冰上迅速分离出视网膜。蛋白裂解液抽提蛋白，等量蛋白常规上样、跑胶、转膜后，加入11000兔抗小鼠Cav-1抗体，4 ℃冰箱内过夜孵育。洗膜后，加入15000辣根过氧化物酶羊抗兔抗体室温下孵育1 h。化学发光法显色，以GAPDH作为内参，比较各组间Cav-1蛋白表达差异。

1.6 免疫荧光检测小鼠过量麻醉处死，收取对照组及AOH模型建立后1 d、2 d、3 d、7 d实验组小鼠眼球，各5只小鼠5眼行冰冻切片。将切好的眼球冰冻切片从-20 ℃冰箱中取出，室温下自然风干1 h以上，浸入1 g·L-1TritonX-100中室温处理10 min。PBS漂洗后用体积分数5%驴血清室温封闭1 h，小鼠来源Cav-1抗体(1200)4 ℃孵育2 h。取出标本，PBS漂洗后驴抗小鼠荧光二抗(11000)常温下孵育1 h。PBS漂洗后封片，于免疫荧光显微镜下观察。

1.7 统计学处理应用Graph Pad软件对数据进行统计学分析。各实验数据均以均数±标准差表示，采用t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 Q-PCR检测结果与对照组比较，Cav-1 mRNA在实验组小鼠造模后1 d的视网膜中即有明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；且这一升高趋势在造模后2 d达到高峰，与造模后1 d比较差异有统计学意义(P<0.05)；随后Cav-1 mRNA表达下降，但在造模后7 d时与对照组比较差异仍有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 各组小鼠视网膜Cav-1 mRNA表达 与对照组相比，*P<0.05

2.2 Western blot检测结果Western blot检测结果显示，Cav-1蛋白在对照组视网膜中表达较低。造模后1 d，实验组小鼠视网膜Cav-1蛋白表达即开始升高，但与对照组相比，差异无统计学意义(P=0.194)；之后Cav-1蛋白表达逐渐升高，于造模后3 d 达到高峰；造模后7 d Cav-1蛋白表达有所降低。与对照组相比，实验组造模后2 d、3 d及7 d Cav-1蛋白表达均较高，差异均有统计学意义(P=0.025、0.012、0.035)。见图2。

图2 Western blot检测各组小鼠视网膜Cav-1蛋白表达 与对照组相比，*P<0.05

2.3 免疫荧光检测结果免疫荧光检测结果显示，对照组Cav-1表达主要分布在视网膜神经节细胞层、内丛状层、外丛状层及脉络膜血管层。与对照组比较，实验组造模后1 d即可见视网膜中Cav-1荧光高表达，并且高表达一直持续，在造模后2 d、3 d及7 d均可检测到高荧光表达(图3)。

图3 免疫荧光检测各组小鼠视网膜Cav-1表达

3 讨论

Cav是细胞脂膜的内陷囊状结构，典型大小为50～100 nm,其在脂质交换、转胞吞、细胞外基质重构、机械力传导以及细胞信号转导等过程中均发挥了重要作用。Cav-1是Cav特异性的结构蛋白，是构成Cav最重要的结构成分。Cav-1在不同疾病模型中的作用不同，其表达呈损伤和组织特异性。当大脑皮层冷损伤引起血-脑屏障破坏后，可见损伤部位Cav-1表达增加[12]；而在大脑缺血-再灌注损伤诱导下，损伤部位Cav-1表达呈早期下降、晚期升高变化[13]；这些研究表明，在相同的组织，不同的损伤机制可诱导不同的Cav-1表达变化。在心肌缺血-再灌注损伤后，损伤部位Cav-1表达降低[14]；而在肝脏缺血-再灌注损伤中，Cav-1呈时间依赖性表达升高[15]；这些研究表明，相同的损伤机制，在不同组织中Cav-1 的表达变化也可能不同。

自从2010年发现Cav-1/2基因多态性与原发性开角型青光眼有关联后，越来越多的研究者开始探索Cav-1在青光眼中的作用。 有研究发现，在Schlemm管内皮细胞和小梁网中富含Cav[16-17]。Clark等[18]研究表明，小梁网细胞使用地塞米松或可溶性CD44可分别诱导Cav-1的表达或磷酸化，这提示Cav-1可能参与了激素性青光眼的发病过程。最近，Aga等[19]在体外培养的眼前节组织块及小梁网细胞中暂时性沉默Cav-1和Cav-2，发现沉默Cav-1增加了房水流出率，而沉默Cav-2减少了房水流出率。该作者在沉默Cav-1或Cav-2的小梁网细胞中也发现了基质增加的完全逆转。最近的研究结果提示，Cav缺失会使传统房水流出通道更易受眼压变化的损伤，而且，Cav-1缺失引起的一氧化氮合成酶高活性会导致房水流出通道蛋白的硝酸化[20]。这些结果提示，Cav-1在维持眼压，尤其是在调节房水流出中发挥了重要作用。

Cav-1是否只通过房水流出通道参与青光眼的病理过程？在成年小鼠视网膜，Cav-1是主要的可检测到的Cav蛋白家族成员，其高表达于视网膜、脉络膜血管和Müler细胞，低表达于RPE[1]。Cav-1以及形态可辨的Cav在视网膜的表达及分布提示其在视网膜功能中的重要作用。在Cav-1基因敲除小鼠中，研究者发现，暗适应视网膜电流图的a波及b波均受到了显著影响。通过使用增强磁共振进行体内功能测试，Li等[21]发现，Cav-1基因敲除小鼠暗适应下离子摄取被显著抑制，这提示光感受器暗电流的减少。这些研究均提示，光感受器内的Cav-1对光感受器功能的维持很重要。Cav-1的重要性在于维持视网膜的微环境，从而保持神经功能。其可能的原因是，Cav-1缺失改变了光感受器周围的离子环境。本研究中通过Q-PCR、Western blot以及免疫荧光检测等方法均发现，Cav-1在AOH模型中表达随再灌注时间的延长而逐渐升高，达到高峰后逐渐降低。这一发现表明，Cav-1参与了AOH的病理过程，但在其中的作用目前还不清楚。

综上所述，本研究发现，AOH模型中有Cav-1表达的明显变化，其结果初步提示Cav-1参与了AOH的病理过程。但Cav-1在AOH模型中表达升高的意义是什么，其参与AOH病理过程的机制是什么，对AOH病理过程是损伤还是保护作用等问题均有待进一步研究。