抗人转化生长因子β1纳米抗体的制备及功能鉴定

王 玥，李 峥，陈 慧，张建民*，何 维*

(1.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 免疫学系，北京 100005；2.北京格根生物科技有限公司，北京 100005)

转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)是调节细胞生长、分化和免疫功能的细胞因子之一。目前人类TGF-β超家族成员中TGF-β1的功能研究最为透彻[1]。TGF-β1在许多肿瘤中高表达；临床上，肿瘤患者血清中TGF-β1的水平与肿瘤恶性程度及预后也密切相关[2]。TGF-β1与其受体结合后，能促进肿瘤的生长及侵袭转移；TGF-β1还可抑制细胞毒性T淋巴细胞分化、降低树突状细胞的抗原呈递能力、抑制IFN-γ(γ干扰素，interferon-γ)和TNF-α(肿瘤坏死因子α，tumor necrosis factor α)的产生等[3]。由此可见，TGF-β1能抑制抗肿瘤免疫应答，在肿瘤免疫逃逸过程中扮演着重要角色，故通过中和抗体封闭TGF-β1是肿瘤免疫治疗的关键点之一。

已有研究表明，靶向TGF-β1信号通路的封闭抗体，如抗TGF-β1抗体fresolimumab[4]、抗TGF-β1受体抗体lapatimab等，可以抑制肿瘤的生长和迁移；然而大部分完整抗体存在免疫原性高、易粘黏聚集和易被蛋白酶降解等缺点。纳米抗体(nanobodies or nanoantibodies)是羊驼外周血中天然缺失轻链的特殊抗体，该抗体仅由重链可变区(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)和恒定区(cons-tant region, CH2、CH3)组成，单独的VHH区具有同样特异的抗原结合能力[5-6]。因此，靶向TGF-β1的新型纳米抗体能弥补传统TGF-β1抗体的固有缺陷，在抗肿瘤免疫治疗中具有广阔的应用前景。

基于此，本研究旨在制备并鉴定羊驼来源的高特异性、高亲和力的抗TGF-β1纳米抗体，为其临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌DH5α、M13K07辅助噬菌体(北京全式金生物技术公司)；cFUGW真核表达载体、pGEX6P.1原核表达载体、人胚胎肾上皮细胞系HEK-293T、人肺癌细胞系NCI-H520(本实验室保存)；GSTrapTMFF 1 mL色谱柱(GE公司)；抗His单克隆抗体、抗GST单克隆抗体(CST公司)；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠和HRP标记的羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 真核表达质粒cFUGW-TGF-β1的构建与蛋白表达纯化：通过PCR引物，分别在TGF-β1两端引入AgeⅠ和EcoRⅠ酶切位点，并设计6×His用于重组蛋白的纯化；挑取文库内TGF-β1菌为模板进行PCR。利用AgeⅠ和EcoRⅠ分别对cFUGW空载体及PCR纯化产物进行酶切、连接并转化，得到cFUGW-TGF-β1重组质粒。瞬时转染HEK-293T细胞，收集48～72 h的细胞培养上清，纯化带有His标签的目的蛋白；用Western blot检测蛋白表达及其纯度。

1.2.2 羊驼噬菌体VHHs展示文库的构建：初次免疫将1 mg TGF-β1纯化蛋白1：1充分乳化于完全弗氏佐剂，采用皮下注射的方式免疫羊驼；之后使用不完全弗氏佐剂，蛋白剂量为0.5 mg/次；共免疫5次，单次间隔为20 d。在最后一次加强免疫3～4 d后，于被免疫羊驼颈静脉处采集100 mL抗凝血。提取外周血单个核细胞，提取RNA，反转录为cDNA。分别利用CALL001引物、CALL002引物和VHH-BACK引物、聚合酶链反应引物(polymerase chain reaction primers，PMCF)引物(表1)进行2轮巢式PCR，纯化400 bp的扩增条带，即得到重链可变区(VHH)片段。

表1 噬菌体文库构建所用引物Table 1 Primers for phage library construction

将纯化的巢式PCR产物与pMCES载体连接后，电转化至大肠杆菌中；经单克隆挑取、菌落PCR后，推算羊驼TGF-β1-VHH噬菌体抗体库容量(克隆数×稀释倍数×104)。

1.2.3 TGF-β1-VHH纳米抗体的特异性筛选：取VHH库，加入M13K07辅助噬菌体培养，在ELISA板中预包被TGF-β1纯化蛋白，分别使用噬菌体颗粒作为一抗，羊抗驼IgG-HRP作为二抗，显色后读取405 nm处吸光度值。

1.2.4 TGF-β1-VHH纳米抗体的原核诱导表达与纯化：将阳性重组噬菌体与pGEX6P.1-GST原核表达载体连接，构建pGEX6P.1-VHH原核表达质粒。对阳性菌株进行原核诱导表达，分别收集上清及包涵体检测表达情况；细菌裂解液上清经GSTrapTMFF 1 mL色谱柱纯化，Western blot检测其表达。

1.2.5 TGF-β1-VHH纳米抗体的结合特异性检测：利用TGF-β1-VHH纳米抗体B3、C8或市售兔源TGF-β1单抗为一抗，分别用Western blot和免疫荧光，检测其与NCI-H520细胞全蛋白裂解液中的和NCI-H520细胞爬片上的TGF-β1蛋白的结合。

1.2.6 ForteBio Octer®检测分子相互作用实验:将TGF-β1纯化蛋白梯度稀释，利用TGF-β1-VHH纳米抗体B3和C8的GST标签与预装GST传感器偶联，利用生物传感器原理，检测不同浓度的TGF-β1纯蛋白与纳米抗体的结合情况，计算亲和力。

2 结果

2.1 真核表达质粒cFUGW-TGF-β1的构建与鉴定

经PCR扩增的人TGF-β1标准全长DNA序列，长度为1 188 bp(图1A)；双酶切鉴定显示3 518 bp和6 895 bp的两条条带(图1B)，提示cFUGW-TGF-β1重组质粒构建成功。

A.arrow was the PCR product of target gene；M.1 ku DNA ladder B.lane1～3 showed plasmid cFUGW-TGF-β1 digested by Pac Ⅰ and Ahd Ⅰ；lane 4 was used as a negative control；M.1 ku DNA ladder图1 真核表达质粒cFUGW-TGF-β1的构建与鉴定Fig 1 Construction and identification of eukaryotic expression plasmid cFUGW-TGF-β1

2.2 重组TGF-β1蛋白的表达纯化及鉴定

cFUGW-TGF-β1重组质粒无荧光出现(图2B)，同期空载质粒可以正常检测到绿色荧光(图2A)。转染293T细胞培养上清中可以成功检测到潜在型相关肽(latency-associated peptide，LAP)前体、TGF-β1单体及少量二聚体，而细胞裂解液中仅检测到LAP前体；未转染293T细胞上清也可检测到少量LAP前体的表达(图2C)。

HisTrap填料对转染293T细胞培养上清进行亲和层析的结果显示，Lane 3/4孔内三种形式的TGF-β1均得到较好的纯化(图3)。

2.3 羊驼噬菌体文库的构建与TGF-β1-VHH纳米抗体的亲和筛选

2次PCR分别获得700 bp的通用抗体重链VH(图4A)和400 bp的TGF-β1-VHH片段(图4B)。菌落PCR结果显示，TGF-β1-VHH片段的阳性克隆率在70%左右(图4C)；根据公式估算羊驼TGF-β1-VHH噬菌体库菌板(图4D)的有效库容可达1.2×108。

ELLSA检测随机挑选的21株克隆与重组TGF-β1蛋白的结合情况，筛选得到B3、C5、C8、F4、F6、G6和G8，7株阳性克隆(图5)。

A.cFUGW/BF; B.cFUGW-TGF-β1/BF; C.Western blot of recombinant TGF-β1 protein expression; 1/2 was supernatant/cell lysate of untransfected group；3/4～5/6 were of transfection group；M.protein marker

图2 重组TGF-β1蛋白在HEK-293T细胞中的瞬时表达
Fig 2 Identification of transient expression of recombinant TGF-β1 protein in HEK-293T cells

A.coomassie brilliant blue; B.Western blot experiments identified purification：1.supernatant before purification；2.flow-through solution；3-7.different purification elution wells；M.protein marker

图3 重组TGF-β1的纯化与鉴定
Fig 3 Purification and identification of recombinant TGF-β1 proteins

A:1-7.PCR1 amplified VH gene fragments, M.1 ku DNA ladder; B：1-6.PCR2 amplified VHH gene fragments, M.1 ku DNA ladder; C:colony PCR identification of phage library; D: phage library plates at 1∶10 000 000 and 1∶100 000 dilutions

图4 TGF-β1-VHH噬菌体展示库构建
Fig 4 Construction of TGF-β1-VHH phage display library

2.4 TGF-β1-VHH纳米抗体的原核诱导表达与纯化

电泳及Western blot结果显示，TGF-β1-VHH纳米抗体与GST融合蛋白(分子质量为36 ku)在上清和包涵体中均得到了表达(图6A,B)。高表达克隆株B3和C8纯化后上清中纳米抗体可得到有效富集(图6C,D)。

2.5 TGF-β1-VHH纳米抗体的结合特异性检测

纯化后B3、C8纳米抗体及市售TGF-β1抗体对TGF-β1均有较好的结合，其中市售抗体的非特异性背景更低，纳米抗体B3略优于C8(图7A)。免疫荧光结果显示，市售抗体对NCI-H520细胞表面TGF-β1的识别更为特异，B3略强于C8(图7B)，与Western blot结果相吻合。

融合表达的纳米抗体B3和C8与TGF-β1蛋白的亲和力检测显示，二者属于慢结合和慢解离模式，亲和力常数KD(M)分别为1.48×10-9mol/L、9×10-9mol/L，均属于较强结合(图8)。

B3～G8 monoclones were randomly selected; the arrows showed 7 positive clones; the negative control BL was PBS图5 TGF-β1-VHH纳米抗体的结合特性Fig 5 Binding activities of TGF-β1-VHH nanobodies

A，B.lane1/2-13/14 refered to supernatant/inclusion bodies of C5，F6，C8，F4，B3，G6 and G8; C，D.lane1/2-3/4 refered to supernatant/inclusion bodies of B3 and C8 before purification；lane5/6～7/8 refered to supernatant/inclusion bodies of B3 and C8 after purification

图6 TGF-β1-VHH纳米抗体的原核表达与纯化
Fig 6 Prokaryotic expression and purification of TGF-β1-VHH nanobodies

A.Western blot detection of nanobodies; Samples of lane1-12 were 10 μg tumor cell lysate；M.protein marker; B.immunofluorescence detection of nanobodies

图7 TGF-β1-VHH纳米抗体与NCI-H520细胞的TGF-β1结合特异性检测
Fig 7 Binding assay of TGF-β1-VHH nanobodies with NCI-H520 cells

different colors are gradient diluted TGF-β1 protein图8 TGF-β1-VHH纳米抗体与TGF-β1的亲和力检测Fig 8 Affinities of TGF-β1-VHH nanobodies with recombinant TGF-β1 proteins

3 讨论

TGF-β1是一类典型的免疫抑制性细胞因子，肿瘤微环境中的TGF-β1在肿瘤免疫逃逸中至关重要，促进肿瘤发生发展。

人的TGF-β1首先形成LAP前体，被水解后，可释放出成熟TGF-β1单体或二聚体。在本研究中用于免疫羊驼的纯化蛋白包含LAP前体、TGF-β1单体及二聚体，故所得纳米抗体可同时识别三种形式的TGF-β1。

纳米抗体是目前已知天然来源的最小抗原结合单位，同时它还是理想的靶向示踪分子，通过偶联不同物质进行放射免疫成像等可精确诊断多种疾病[7-9]。它兼具小分子药物与传统抗体的优势：稳定性高、特异性强、可穿透血脑屏障、人源化、简单且适用于多种表达系统[10]。本研究制备的B3和C8等纳米抗体，可有效中和肿瘤微环境中自分泌或旁分泌TGF-β1，有望在抵消肿瘤免疫逃逸、抑制肿瘤的发生发展中发挥重要作用。