锑和砷对固氮菌的毒性效应及其机制研究

2020-05-29孔天乐孙晓旭孙蔚旻

生态环境学报 2020年3期

孔天乐，孙晓旭，孙蔚旻*

1.广州大学环境科学与工程学院，广东广州 510006；2.广东省生态环境技术研究所/广东省农业环境综合治理重点实验室，广东广州 510650；3.华南土壤污染控制与修复国家地方联合工程研究中心，广东广州 510650

锑（Antimony，Sb）是一种具有毒性和致癌性的类金属，被广泛运用于工业半导体、杀虫剂及阻燃剂等产品中（薛亮等，2014）。作为世界上锑储量和开采量最大的国家，中国锑矿开采造成的环境污染问题尤为严重（Dupont et al.，2016），例如拥有“世界锑都”之称的湖南锡矿山周边农用土壤中的锑含量为141.92—8733.26 mg·kg-1，远远超过世界土壤背景值规定的1 mg·kg-1（莫昌琍等，2013）。此外，锑矿中常伴有化学性质和毒性相似的类金属砷（Arsenic，As）存在，从而造成锑矿区及其周边环境同时受到锑和砷污染（崔晓丹等，2015；莫昌琍等，2013；Okkenhaug et al.，2012），均被美国国家环境保护局（USEPA）认定为一级污染物（Yamamura et al.，2014）。在环境中Sb和As的赋存价态主要为 Sb(V)和 As(V)，而且其毒性主要取决于它们在化合物中的价态，通常表现为As(III)和Sb(III)较 As(V)和 Sb(V)毒性更强（Wilson et al.，2010；文吉昌等，2016）。若人类长期暴露在高锑、高砷环境中会引起许多健康问题，例如：心律紊乱、皮肤病、癌症、甚至遗传性疾病（邱丽娟等，2018；王年等，2017）。目前有关砷的毒性研究较为完善，而对于锑毒性的相关报道仍然相对较少，尤其是在环境毒理学方面的研究。因此，进一步解析锑污染的环境行为亟待展开。

土壤中高浓度的重（类）金属胁迫往往会伴随着营养元素的匮乏，例如碳和氮元素等（刘晨等，2018）。氮素作为植物生长需求量最大的必需元素（Souza et al.，2014），其缺乏严重阻碍环境生物恢复的有效实施。氮肥是缓解氮素缺乏行之有效的策略，但其不合理的施用会对生态环境造成严重的负面影响（陆宇燕等，2014）。生物固氮是将空气中氮气转化为生物可利用态氮的能力，其固氮效率称为固氮潜能（Nitrogen-fixation potential，NFP），也是缓解氮素缺乏经济高效的潜在替代方法。因此，固氮微生物（如棕色固氮菌等）在重（类）金属污染土壤修复中起到了非常的重要作用，不仅为自然生态环境提供了主要的氮素来源（Titus et al.，2014），还可以改善土壤中的矿物成分和影响土壤重（类）金属的活性（李雯等，2014；刘晨等，2018）。

土壤微生物学参数是衡量生态环境健康的重要指标，不仅可以反映土壤营养质量的变化，还可以作为监测土壤污染的敏感指标（蒋先军等，2000），而且在重（类）金属胁迫下固氮菌的固氮潜能能够迅速的做出响应，这有利于对重（类）金属污染水平进行及时监测和评估（刘晨等，2018）。然而，目前以固氮菌或其固氮潜能作为监测指标却少有报道，尤其是作为土壤Sb和As污染及毒性的监测指标更鲜有报道。因此，本研究以不同价态的Sb和As作为测试类金属毒物[Sb(V)、Sb(III)、As(V)和As(III)]，研究模式固氮菌株棕色固氮菌应对类金属胁迫时固氮潜能的影响，同时考虑到土壤中Sb和As主要存在价态为Sb(V)和As(V)，进一步探究了土壤固氮微生物固氮潜能对 Sb(V)和 As(V)污染的毒性响应机制。本研究旨在验证固氮菌固氮潜能作为毒性监测和评价的生物指示物的可行性，以及解析固氮微生物固氮潜能对Sb和As污染的毒性响应机制，为有毒重（类）金属的毒性监测和评价以及环境修复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试土壤和固氮菌

为了减少土壤背景带来的干扰，从而更好地研究锑和砷对土壤中固氮菌固氮潜能的毒性影响，本研究供试土壤采自于广东省广州市天河区无锑和砷污染地区（23°19′N，113°362′E），其土壤类型为红壤。供试的模式固氮菌为棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii），采购于广东省微生物菌种保藏中心，其编号为1.1413-DSM720（以下简称为DSM720）。

1.2 主要仪器和试剂

气相色谱仪—7890B（安捷伦公司）；高纯乙炔，佛山德力气体公司配送；酒石酸锑钾（C8H4K2O12Sb2·3H2O）和焦锑酸钾（KSbO6H6）均为分析纯，上海麦克林生化科技有限公司生产；砷酸钠（Na₃AsO₄·12H₂O）为分析纯；亚砷酸钠（NaAsO2）为分析纯；硝酸（HNO3）为优级纯；盐酸（HCl）为优级纯；微波消解仪，型号为CEM Mar5；ICP OES，用于测定土壤各重金属总质量分数；固氮菌固体培养基（Jensen's Medium）和液体培养基（Jensen's Broth）为HiMedia生产，其主要成分见表1。

1.3 供试土壤重金属组成分析

将采集回来的新鲜土壤样品过2 mm（10目）筛子去掉较大颗粒及残枝败叶后，一部分保存于4 ℃用于固氮微生物培养试验。另一部分风干，研磨，过200目筛子待用。称取0.1 g过筛后的土样于消解管中，加入6 mL HCl和2 mL HNO3，预消解1 h，并设置3个重复。微波消解后的消解液进行定容，过滤。最后使用ICP OES对过滤后的消解液进行测定。

表1 固氮菌固体培养基（Jensen's Medium）和液体培养基（Jensen's Broth）成分Table 1 Composition of Azotobacter solid medium (Jensen's Medium) and liquid medium (Jensen's Broth)

1.4 棕色固氮菌固氮潜能对锑和砷的生物指示作用及毒性响应

本研究使用乙炔还原法（ARA）测定固氮微生物的乙烯生成速率，反映固氮微生物固氮潜能，从而探讨锑和砷的毒性效应机制（张颖等，2018）。具体操作如下：在无菌环境下，将菌种DSM720接种到装有灭菌无氮固体培养基（Jensen's Medium）的平板上，并置于30 ℃培养箱中培养3 d，得到活化的棕色固氮菌；然后将活化后的棕色固氮菌在无菌环境下再次接种到装有灭菌无氮固体培养基的平板上，在30 ℃的培养箱中进行3 d的扩大培养，得到实验所需棕色固氮菌；随后将扩大培养得到的棕色固氮菌在无菌环境下等量地接种到装有无氮液体培养基（Jensen's Broth）的灭菌西林瓶中，并向其中加入设置为 0、100、250、500、1000、2500、5000 mg·L-1质量浓度梯度的不同价态锑和砷[Sb(V)、Sb(III)、As(V)和 As(III)]溶液，不同价态锑和砷在每个浓度梯度设置3个重复，接着封好胶塞及瓶盖，再往西林瓶中加入5%（体积分数）的乙炔并用封口膜封好瓶盖以免漏气；最后使用安捷伦气相色谱仪（7890B）分别于培养0、2、4、6、8 d后进行测定。

1.5 五价锑和砷对土壤微生物固氮潜能的毒性

称取2 g过筛后的新鲜土壤分别加入装有无氮液体培养基的灭菌西林瓶中，并向其中加入设置为0、200、500、1000 mg·L-1质量浓度梯度的 Sb(V)和 As(V)溶液（土壤锑和砷主要存在价态），并封好胶塞及瓶盖，接着往西林瓶中加入 5%（体积分数）的乙炔并用封口膜封好瓶盖以免漏气，每个锑和砷浓度水平设置3个重复；最后使用安捷伦气相色谱仪（7890B）分别于培养0、2、4、6、8 d进行测定。

1.6 数据处理

采用Excel处理数据和采用Origin 8.0作图。不同价态锑和砷对土壤固氮微生物及棕色固氮菌的毒性所用指标为半最大效应浓度（Concentration for 50% of maximal effect，EC50），其指的是固氮菌固氮潜能被抑制一半时锑和砷的剂量，使用GraphPad Prism 8进行拟合计算。

2 结果

2.1 供试土壤重金属组成

供试土壤中所有重（类）金属的总质量分数见表 2。结果表明，土壤中锑和砷的总质量分数分别为 0.19 mg·kg-1和 0.22 mg·kg-1，其二者均小于世界土壤背景值。此外，土壤中Fe的总质量分数较高，为 16994.73 mg·kg-1，这可能与供试土壤类型是红壤有关。因此供试土壤为无锑和砷污染的红壤，可用于本研究实验中。

2.2 不同价态的锑和砷对棕色固氮菌固氮潜能的影响

总体而言，棕色固氮菌固氮潜能随金属浓度升高而降低，且不同种类的As和Sb添加对其固氮潜能的影响具有显著差异（图1）。Sb(V)对棕色固氮菌的固氮潜能具有显著的抑制效果（P＜0.05），而且这抑制效果随金属浓度的升高而升高，当 Sb(V)浓度为2500 mg·L-1时其抑制效果达到了约100%；与之相比，Sb(III)对固氮菌固氮潜能的抑制效果更为显著，尤其是当Sb(III)浓度为1000 mg·L-1时其抑制效果达到了约 100%。砷对棕色固氮菌固氮潜能的抑制效果较锑更为显著，抑制效果达到了约100%时 As(V)与 As(III)浓度分别为 500 mg·L-1和250 mg·L-1。由此可见，无论是砷还是锑对棕色固氮菌的固氮潜能均具有抑制效果，且这种抑制效果随着金属浓度的升高而越来越显著。

2.3 不同价态的锑和砷对棕色固氮菌毒性的影响

图1 不同价态和浓度锑和砷对棕色固氮菌固氮潜能（NFP）的影响Fig.1 Effects of different inorganic forms of antimony and arsenic on the nitrogen-fixing potential (NFP) of Azotobacter vinelandii

图2 不同价态锑和砷对棕色固氮菌固氮潜能的毒性Fig.2 Toxicity of antimony and arsenic in different forms to the nitrogenfixing potential of brown nitrogen-fixing bacteria

表2 土壤重金属组成Table 2 Composition of heavy metals in soil

表3 不同价态锑和砷浓度log值（X）与固氮菌固氮抑制率（y）的拟合方程Table 3 Fitting equation of log values (X) of different species of antimony and arsenic concentrations and nitrogen fixation inhibition rate(y) of nitrogen-fixing bacteria

不同价态的锑和砷对棕色固氮菌固氮潜能的影响不尽相同，因此为了更好地解析不同价态的锑和砷对棕色固氮菌固氮潜能的毒理效应，本研究对不同价态锑和砷对棕色固氮菌固氮潜能的毒性进行了进一步分析，发现不同价态的锑和砷对棕色固氮菌固氮潜能的毒性具有较大的差异。由图2和表3可知，As(III)的EC50最低，为17.90 mg·L-1，其次是 Sb(III)，其 EC50为 19.55 mg·L-1，即 Sb(III)和As(III)对棕色固氮菌固氮潜能均表现出极强的毒性，且两者对棕色固氮菌固氮潜能的毒性效果无显著差异（P＞0.05）。与As(III)和Sb(III)相比，As(V)和 Sb(V)的毒性相对较小，且对棕色固氮菌固氮潜能的毒性有着显著的差异（P＜0.05），其EC50分别为 198.40 mg·L-1和 630.80 mg·L-1。由此可得，不同价态锑和砷的EC50差异较大，如As(III)和Sb(V)之间，可达最大差别为35倍。综上所述，不同价态的锑和砷对棕色固氮菌固氮潜能的毒性表现为As(III)＞Sb(III)＞As(V)＞Sb(V)，而且除了 Sb(III)和As(III)之间毒性差异不显著外，其余的两两之间均呈现出显著的差异。

2.4 Sb(V)和As(V)对土壤固氮菌毒性的响应

基于Sb和As对固氮模式菌株的毒性研究基础之上，本研究进一步开展了基于环境中常见 Sb(V)和 As(V)污染价态，对土壤固氮菌群落固氮潜能影响的研究。结果表明，Sb(V)和As(V)对土壤中固氮菌的固氮潜能均存在抑制，且Sb与As的抑制效果具有较大差异（图3）。根据拟合结果发现Sb(V)和As(V)对土壤固氮菌群落的 EC50（即对土壤中固氮菌群落的毒性）呈现出显著的差异（P＜0.05），分别为 3808.00 mg·L-1和 295.10 mg·L-1（表 4）。由此可得，Sb(V)和As(V)对土壤固氮菌固氮潜能的毒性表现为 As(V)＞Sb(V)，且 As(V)对土壤中固氮菌固氮潜能的毒性较Sb(V)强约为13倍。

3 讨论

图3 Sb(V)和As(V)对土壤固氮菌固氮潜能的毒性Fig.3 Toxicity of Sb (V) and As (V) to the nitrogen-fixing potential of soil nitrogen-fixing bacteria

表4 Sb(V)和As(V)浓度log值（X）与固氮菌固氮抑制率（y）的拟合方程Table 4 Fitting equation of log values (X) of Sb(V) and As(V) concentrations and nitrogen fixation inhibition rate (y) of nitrogen-fixing bacteria

中国锑矿开采和冶炼引起的锑和砷污染不仅危及人类的生命健康而且土壤微生物群落结构分布及功能造成影响（He et al.，2019）。土壤微生物对土壤结构的形成及功能等起着重要的作用，例如固氮微生物作为生态系统中重要的功能菌群之一，对维持氮循环平衡以及环境修复均起到了不可或缺的作用（Dixon et al.，2004；刘璐等，2017）。土壤中固氮菌的固氮潜能在重金属（如砷）的作用下会受到抑制，而且随着土壤中重金属浓度的升高呈现出显著的负相关（王淑芳等，1991；伍玲丽等，2019），因此以固氮菌作为重金属毒性的生物指示物具有敏感性和代表性（廖瑞章等，1989；刘晨等，2018）。本研究以不同价态及质量浓度的锑和砷对模式固氮菌株棕色固氮菌进行试验，发现固氮菌固氮潜能可以灵敏有效地反映出锑和砷污染情况，并且随Sb和As质量浓度的增加，棕色固氮菌固氮潜能呈现显著的负相关（图 1），因此棕色固氮菌固氮潜能作为锑和砷污染的生物指示物是可行的。锑和砷对细胞呼吸、ATP合成以及酶活性均具有抑制效果（Guillamot et al.，2014；朱参胜等，2009），这可能导致了棕色固氮菌的代谢和固氮酶活性随锑和砷浓度的升高而减弱，使其生长繁殖能力和对氮气的利用率降低，进而导致棕色固氮菌的固氮潜能下降。

在污染环境中，重（类）金属的存在价态及其浓度对固氮菌固氮潜能均具有影响（Zalaghi et al.，2014）。同样，本研究也发现暴露于不同价态锑和砷中的棕色固氮菌固氮潜能所受到的抑制作用与金属的质量浓度及其存在价态有直接的联系。As和Sb对棕色固氮菌固氮潜能的毒性均表现为五价形态显著弱于三价形态，这与以往锑和砷相关研究中报道的二者毒性强弱结果一致（Wilson et al.，2010）。研究表明Sb(III)和As(III)对细菌环形DNA造成不同程度损坏（He et al.，2019；Zhou et al.，2008），这可能是导致本研究中As(III)和Sb(III)的毒性均显著高于 As(V)和 Sb(V)的原因，即随着 Sb(III)和As(III)浓度的增加，被致裂的棕色固氮菌数量也随之升高，从而使棕色固氮菌固氮潜能受到的抑制作用增强。此外，微生物对重金属的响应随其种类的不同而存在差异（An et al.，2009；Hassen et al.，1998；伍玲丽等，2019），例如Sb(III)对大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的特异性生长速率的EC50分别为 555、18.4、15.8 mg·L-1，表明棕色固氮菌对不同价态的Sb和As存在明显的敏感性差异，这可能与造成了Sb(III)和As(III)对棕色固氮菌固氮潜能的毒性显著强于 Sb(V)和 As(V)有关，同时验证了利用固氮微生物固氮潜能作为锑和砷污染生物指示物的可行性。

本研究锑和砷污染对土壤中固氮菌固氮潜能同样存在显著抑制，证实了固氮微生物固氮潜能作为生物指示物的可行性。自然环境中，Sb和As的毒性很大程度上取决于其存在价态（Kong et al.，2015）。同时，土壤中的锑和砷污染物均以五价为主，且其占比均大于 90%（Newton et al.，2006；Okkenhaug et al.，2011；刘冠男等，2018；周建伟等，2017）。因此，本研究利用Sb和As在土壤中主要赋存价态[Sb(V)和As(V)]，分别对土壤中固氮菌固氮潜能和棕色固氮菌固氮潜能的毒性效应进行比较。结果表明，Sb(V)和As(V)对棕色固氮菌和土壤中固氮菌固氮潜能均有明显的抑制作用。通过EC50对比结果发现，Sb(V)和As(V)对棕色固氮菌固氮潜能的毒性都分别强于对土壤中固氮菌固氮潜能的毒性，尤其是 Sb(V)对棕色固氮菌固氮潜能的毒性比对土壤中固氮菌群落固氮潜能的毒性强了约6倍。EC50呈现出如此差异一方面可能与不同菌种对锑和砷污染的响应不同有关。有研究发现特异性微生物对重金属离子作用的途径包括吸附、转化、降解和积累等（刘晨等，2018；Schwitzguébel et al.，2002），它们可以通过产生配体，自身分泌物或酶等对重金属离子进行氧化，还原或者降解，从而影响重金属的迁移及生物毒性。土壤中特异性微生物群落结构复杂，其中固氮微生物物种亦是丰富多样，例如：固氮螺菌、红假单胞菌属、假单胞菌属等等（侯海军等，2014；Zou et al.，2011）。因此，与土壤丰富的微生物（固氮菌）群落和功能多样性相比，作为单一菌落的棕色固氮菌对重金属作用机制却较为单一，没有如土壤中丰富的微生物群落拥有更为丰富抗毒机制，从而造成Sb(V)和As(V)对棕色固氮菌固氮潜能的毒性都分别强于对土壤中固氮菌固氮潜能的毒性。另一方面可能与土壤中理化性质（如pH、粘粒含量、有机质含量、碳酸盐含量及铁、铝、锰氧化物等）对重金属的吸附或络合等有关（李璐璐，2014；陈同斌等，2003），从而影响重金属在土壤中的迁移转化及其毒性。同时，实验土壤采自于南方红壤带，其中铁含量高（见表1），更易于吸附锑和砷。因此，当外源Sb(V)和As(V)添加到实验土壤中后就很有可能被吸附或者络合成迁移性低的结合态化合物，从而降低了Sb(V)和As(V)对固氮菌固氮潜能的毒害影响，也导致 Sb(V)和 As(V)对棕色固氮菌固氮潜能的毒性都分别强于对土壤中固氮菌固氮潜能的毒性。