miRNA-126对脑缺血再灌注损伤小鼠炎症反应的抑制作用

肖 莉，熊明敏，王志强，丁 鑫，谢 馨

0 引 言

脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury, CIRI)是指脑缺血一定时间内在恢复血液供应后，大脑功能不仅没有得到及时恢复，反而出现更加严重的脑神经功能障碍[1]。脑缺血再灌注损伤机制十分复杂，可能与过量氧自由基的生成、炎症反应及能量代谢等有着密切的关系[2]。miRNA与多种疾病有关，其与脑血管疾病也密不可分。miRNA-126在血管炎症中起着关键作用，Yuan X等[3]发现，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)损伤的血管内皮细胞(vein endothelial cells, VECS)中上调miRNA-126的表达后，可抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路的激活，从而抑制血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)的表达，对预防和治疗动脉粥样硬化有重要意义。核κB(NF-κB)是一个关键的转录因子，它促进了编码促炎性细胞因子的基因的转录，如TNF-a、IL-1β和IL-6等[4]，这些基因可能与脑缺血再灌注引起的炎症反应具有密切联系。而NF-κB的激活是原始的信号激活事件，能够导致细胞机能紊乱和损伤的其他通路激活。[5]。研究发现，在IBD患者的粘膜巨噬细胞和结肠上皮细胞中发现了NF-κB的激活，结果表明NF-κB/NLRP3轴可能是炎症性肠病患者开发新疗法的潜在目标[6]。因此，本研究探讨miRNA-126通过NLRP3/NF-κB信号轴对脑缺血再灌注损伤小鼠的影响，为治疗缺血再灌注脑损伤提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物选择SPF级雄性小鼠共48只，体重25～30 g，年龄8～10周，SPF级，温度18～29 ℃，相对湿度40%～60%，自由饮食饮水。实验动物购自中国科学院昆明动物研究所，动物合格证号：SYXK(滇)K2017-0009。

1.1.2实验试剂TRIzol Reagent(美国Invitrogen公司)，miRNA-126、U6引物(Invitrogen)、NOD样受体蛋白-3(NOD-like receptor pyrindomin-3, NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、NF-κB p65、NF-κB p50、GAPDH普通PCR上下游引物(上海生工公司)，SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)，miRNA-126 agomir、miRNA-126 agomir NC(广州锐博生物技术有限公司)，RIPA裂解液(上海申能博彩生物科技有限公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(Thermo公司)，NLRP3兔抗鼠单抗、NF-κB p65兔抗鼠单抗、NF-κB p50兔抗鼠单抗、p-NF-κB p65兔抗鼠单抗、p-NF-κB p50兔抗鼠单抗(均购自Abcam公司)，ASC兔抗鼠单抗、caspase-1兔抗鼠单抗、HRP标记山羊抗兔IgG(均购自美国Santa Cruze公司)，小鼠IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒(购自欣博盛生物科技有限公司)，其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3主要仪器实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司)、Z216MK型冷冻离心机(德国HERMLE公司)、电泳仪和转膜仪(Bio-Rad公司)、摇床(TS-8)(上海精密仪器制造公司)、化学发光成像系统(GE公司)、脱水机(武汉俊杰电子有限公司)、包埋机(武汉俊杰电子有限公司 )、石蜡切片机(上海徕卡仪器有限公司)、正置光学显微镜(日本尼康)、成像系统(日本尼康)、全自动酶标仪(Thermofisher公司)。

1.2建立小鼠脑缺血再灌注损伤模型0.8%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，应用线栓法制备小鼠脑缺血再灌注损伤模型；栓线通过颈内动脉送入到大脑前动脉和大脑中动脉连接处，使大脑中动脉血供区域缺血，在缺血3 h后，小心取出栓线并结扎颈总动脉残端，再灌注24 h。将48只小鼠随机分为：假手术组(仅切开颈部皮肤，暴露左颈总动脉后结扎，不插入栓线)、模型组(制备小鼠脑缺血再灌注损伤模型，注射等渗盐水)、阴性对照组(模型建立后侧脑室注射miRNA-126阴性对照miRNA-126 agomir NC)、过表达组(模型建立后侧脑室注射miRNA-126激动剂miRNA-126 agomir)，每组12只。

1.3观察指标

1.3.1小鼠神经行为学评分观察小鼠肢体瘫痪、站立、肢体屈曲和行走情况。采用5级4分法进行神经功能评分：无明显神经功能缺损记为0分；左前肢伸展障碍记为1分；行走时向左侧旋转打圈记为2分；行走时向左侧倾倒记为3分；不能自发行走，意识丧失，昏迷记为4分；动物死亡记为5分[7]。评分为0、4和5分的小鼠均被剔除，剔除的小鼠在后续实验中随机再抽取。

1.3.2小鼠脑组织含水量取完整的左侧脑组织后立即放置于电子天平称量湿重，然后将脑组织放置于烘箱内110 ℃烘烤24 h，再放置于电子天平上称重，脑组织含水量计算公式如下：

脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重

1.3.3采用HE染色法观察脑皮质组织病理形态学将脑组织用0.9%等渗盐水漂洗、滤纸、吸干，放入10%中性甲醛溶液中固定48 h，然后进行脱水、石蜡包埋、切片。病理切片厚度为4 μm。将病理切片放置于65℃烘箱2 h后，依次放入二甲苯10 min、无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、50%乙醇各5 min。苏木精-伊红染色。中性树脂封片，镜下观察组织形态及病理改变。

1.3.4采用ELISA法检测小鼠脑组织及血清中IL-1β、IL-6的表达水平将脑组织置于玻璃匀浆器中，按体重体积比1∶9加入等渗盐水在冰浴中充分研磨，制成10%脑匀浆，然后8000 r/min离心，离心半径6.9 cm，离心10 min，取上清，ELISA法检测各组小鼠脑组织及血清中炎性细胞因子IL-1β和IL-6的表达水平。

1.3.5采用RT-PCR法检测各组小鼠脑组织miRNA-126mRNA表达水平Trizol法提取脑组织及外周血总RNA，逆转录获得cDNA，miRNA-126以U6作为内参，采用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测各组细胞miRNA-126基因的表达水平。引物由上海生工公司设计合成，引物设计如下：miRNA-126上游5′-CTGCTCGACCTCGGAAACTATG-3′，下游5′-AGCATGAATCGTACCGTGAGT-3′；U6上游5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，62 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。扩增完毕后进行熔解曲线分析，每个样本重复检测3次。每组miRNA-126基因的相对表达量按公式(2-△△Ct法)计算。

1.3.6采用Westernblot法检测各组小鼠脑组织NLRP3、ASC、caspase-1、NF-κB p65、NF-κB p50、p-NF-κB p65、p-NF-κB p50的蛋白表达水平取脑组织加入RIPA 细胞裂解液于冰上提取总蛋白，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒对蛋白进行定量。将蛋白样品与上样缓冲液混匀，沸水浴加热变性，取等量变性蛋白样品加入上样孔，SDS-PAGE凝胶电泳。待蛋白分离后转膜至PVDF膜上，在质量浓度为5%脱脂奶粉中封闭1 h，TBST洗膜后加入一抗(1∶1500稀释)，4 ℃过夜，TBST洗膜后再加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3000稀释)，室温1 h，TBST洗膜后以ECL化学发光，于暗室成像拍照，以β-actin为内标蛋白，用Bandscan 5.0软件分析各组细胞中蛋白条带总灰度值，检测各组NLRP3、ASC、caspase-1、NF-κB p65、NF-κB p50、p-NF-κB p65、p-NF-κB p50蛋白相对表达水平。

1.3.7采用RT-PCR法检测各组小鼠脑组织NLRP3、ASC、caspase-1、NF-κB p65、NF-κB p50的mRNA表达水平以GAPDH为内参，分别检测小鼠脑组织NLRP3、ASC、caspase-1、NF-κB p65、NF-κB p50的mRNA表达水平。引物由上海生工公司设计合成，引物设计如下：NLRP3上游5′-GGAGAGACCTTTATGAGAAAGCAA-3′，下游5′-GCTGTCTTCCTGGCATATCACA-3′；ASC上游5′-AAGCCAGGCCTGCACTTTAT-3′，下游5′-CTGGTACTGCTCATCCGTC-3′；caspase-1上游5′-GCCTGTTCCTGTGATGTGGA-3′，下游5′-TTCACTTCCTGCCCACAGAC-3′；NF-κB p65上游5′-TCCGGCAACAGCACAGACC-3′，下游5′-GAGAAGTCCATGTCCGCAAT-3′；NF-κB p50上游5′-CGATTCCGCTATGTGTGTGA-3′，下游5′-GTCCTTGGGTCCTGCTGTT-3′；GAPDH上游5′-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3′，下游5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。

2 结 果

2.1小鼠神经行为学评分模型组、阴性对照组及过表达组神经行为学评分较假手术组显著升高(P<0.05)；过表达组神经行为学评分较阴性对照组、模型组显著降低(P<0.05)。见表1。提示脑缺血/再灌注模型小鼠存在脑神经功能损伤，过表达miRNA-126可改善小鼠神经损伤。

2.2各组小鼠脑组织含水量比较模型组、阴性对照组小鼠脑组织含水量较假手术组显著升高(P<0.05)。过表达组脑组织含水量较模型组显著降低(P<0.05)。提示过表达miRNA-126可降低模型组脑组织含水量，见表1。

组别神经行为学评分(分)脑组织含水量(%)假手术组077.71±2.41模型组2.33±0.14*87.20±3.23*阴性对照组2.25±0.45*87.37±2.61*过表达组1.75±0.22*#△80.54±2.65*#△

与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与阴性对照组比较，△P<0.05

2.3各组小鼠脑皮质病理形态学变化HE染色结果显示，假手术组小鼠脑皮质形态结构正常、神经纤维排列密集、整齐。模型组和阴性对照组小鼠脑皮质出现明显破裂、细胞明显坏死且排列紊乱，出现细胞核固缩、间质水肿明显。过表达组小鼠脑皮质病理形态学较模型组有显著改善，坏死细胞数量减少，排列较密集、较整齐，间质水肿现象明显变少。提示建立脑缺血再灌注损伤小鼠模型成功。见图1。

2.4各组小鼠脑组织中miRNA-126 mRNA表达水平比较模型组和阴性对照组小鼠脑组织miRNA-126 mRNA表达水平较假手术组显著降低(P<0.05)；过表达组小鼠miRNA-126 mRNA表达水平较其他3组显著升高(P<0.05)。提示成功建立miRNA-126过表达模型小鼠，见图2。

2.5各组小鼠脑组织及血清中炎性细胞因子IL-1β和IL-6的表达水平比较模型组和阴性对照组小鼠脑组织及血清中IL-1β和IL-6表达较假手术组显著升高(P<0.05)；过表达组IL-1β和IL-6表达水平较模型组和阴性对照组显著降低(P<0.05)。提示过表达miRNA-126可降低模型小鼠脑组织及血清的炎症水平，见表2。

2.6各组小鼠脑组织NLRP3/NF-κB信号轴相关蛋白表达水平比较模型组和阴性对照组小鼠脑组织NLRP3、ASC、caspase-1、NF-κB p65、NF-κB p50、p-NF-κB p65、p-NF-κB p50蛋白表达水平较假手术组显著升高；过表达组NLRP3、ASC、caspase-1、NF-κB p65、NF-κB p50、p-NF-κB p65、p-NF-κB p50蛋白表达水平较模型组和阴性对照组显著降低。见图3。

a:假手术组; b:模型组; c:阴性对照组; d:过表达组

图 1 各组小鼠脑皮质病理形态学变化(HE ×200)

Figure 1 pathomorphological changes of cerebral cortex of mice in each group (HE ×200)

与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与阴性对照组比较，△P<0.05

图 2 各组小鼠脑组织miRNA-126 mRNA表达水平

Figure 2 expression level of miRNA-126 in brain tissue of mice in each group

组别脑组织IL-1βIL-6血清IL-1βIL-6假手术组53.10±4.3210.05±0.470.46±0.040.17±0.03模型组67.90±3.89*15.38±0.36*1.39±0.05*0.85±0.04*阴性对照组66.44±5.43*15.61±0.55*1.36±0.05*0.87±0.03*过表达组56.74±5.76#△12.62±0.49*#△0.77±0.06*#△0.57±0.03*#△

与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与阴性对照组比较，△P<0.05

1:假手术组; 2:模型组; 3:阴性对照组; 4:过表达组

图 3 各组小鼠脑组织NLRP3/NF-κB信号轴相关蛋白表达水平

Figure 3 expression level of axis-related protein of NLRP3/NF- κB signal in brain tissue of mice in each group

2.7各组小鼠脑组织中NLRP3、ASC、caspase-1、NF-κB p65、NF-κB p50的mRNA表达水平比较模型组和阴性对照组小鼠脑组织中NLRP3、ASC、caspase-1、NF-κB p65、NF-κB p50 mRNA表达水平较假手术组显著升高(P<0.05)；过表达组NLRP3、ASC、caspase-1、NF-κB p65、NF-κB p50 mRNA表达水平较模型组、阴性对照组显著降低(P<0.05)。提示模型组NLRP3/NF-κB信号轴激活，而过表达miRNA-126可降低NLRP3/NF-κB信号轴相关基因的蛋白和mRNA表达水平，见表3。

组别NLRP3ASCcaspase-1NF-κB p65NF-κB p50假手术组0.37±0.060.24±0.050.17±0.030.53±0.020.22±0.01模型组1.18±0.13*0.97±0.08*0.91±0.08*1.92±0.11*0.76±0.06*阴性对照组1.25±0.10*0.92±0.06*0.95±0.04*1.86±0.07*0.77±0.11*过表达组0.56±0. 09*#△0.54±0.07*#△0.49±0.06*#△1.15±0.10*#△0.46±0.08*#△

与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与阴性对照组比较，△P<0.05

3 讨 论

缺血性脑卒中是老年人常见疾病，该疾病的高发病率、高死亡率以及高致残率特点使其成为全球关注的健康难题，脑缺血再灌注损伤是脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，反而出现了更严重的脑机能障碍[8-9]。脑缺血再灌注是复杂的病理生理性变化，其涉及到的细胞因子及相互机制较为复杂[10]。炎性反应在脑缺血/再灌注损伤中起着关键性作用，脑缺血局部组织再灌注时会出现脑损伤，其重要的原因就是炎症反应所介导微血管功能障碍[11-13]。研究表明，脑缺血后脑组织中的炎症细胞迅速活化，大量表达炎性细胞因子，而这些细胞因子可向胞外释放大量的氧自由基、细胞因子等炎症介质，加重脑组织损伤，引起脑缺血再灌注损伤[14]。IL-1β和IL-6在炎性反应和脑缺血损伤中具有重要作用，它们能诱导其他炎性介质的产生启动多种细胞因子的反应[15]。在脑缺血再灌注损伤中，IL-1β能够协同其他细胞因子促进B、T细胞活化，并能诱导炎性因子TNF-α的产生；大鼠在脑缺血再灌注12 h后，IL-6的表达已经开始增高[16-17]。本研究结果提示本研究模型建立成功，且模型组小鼠脑组织炎性水平显著增高，与上述参考文献结果一致。

NF-κB是一种典型的炎症途径，主要由p65和p50亚单位组成，参与调节体内的细胞因子、炎症分子等基因的表达，包括IL-1β、IL-6和TNF-α[18]。目前，NF-κB被激活在缺血性脑中风引起的神经细胞死亡中的作用备受关注，成为治疗缺血性脑血管病一个重要的靶点[19]。张文艳等[20]研究发现NF-κB是脑缺血再灌注损伤炎症机制中的一个关键因子，在脑缺血中发挥重要作用。NF-κB被激活后产生大量自由基和炎症因子IL-1β、IL-6，使脑缺血再灌注模型大鼠脑损伤和神经损伤进一步加剧[21]。易敏等[22]研究发现，NLRP3的激活对脑缺血再灌注小鼠脑损伤的发生具有促进作用，其主要是通过增加细胞因子的释放和促进神经元凋亡发挥作用。本研究发现，与假手术组相比，模型组和阴性对照组小鼠脑组织NLRP3、ASC、caspase-1、NF-κB p65、NF-κB p50、p-NF-κB p65、p-NF-κB p50蛋白表达水平及NLRP3、ASC、caspase-1、NF-κB p65、NF-κB p50 mRNA表达水平均显著升高，提示脑缺血再灌注小鼠NLRP3/NF-κB信号轴激活，促进脑缺血再灌注的炎性水平。

有研究表明，miRNA-126除了可以调控血管生长外，还可参与内皮细胞对于系统性炎症的应答[23]。Feng等[24]报道，miRNA-126在结肠上皮细胞中可靶向结合IκBα参与溃疡性结肠炎的炎症进程；过度表达的miRNA-126通过下调IκBα抑制了NF-κB信号通路的激活。郭佳等[25]研究发现，miRNA-126 agomir给药组脊髓损伤动物模型脊髓组织中IL-1β和IL-7等炎症因子表达水平显著降低，上调miRNA-126对脊髓损伤起保护作用。本研究结果与上述研究结果一致。上述研究结果提示miRNA-126可调控NLRP3/NF-κB信号轴，调节缺血再灌注损伤后炎症因子的分泌，从而改善缺血再灌注小鼠脑组织的炎症微环境，这可能是miRNA-126改善脑缺血再灌注损伤的作用机制之一。

综上，过表达miRNA-126可抑制NLRP3/NF-κB信号轴相关基因的表达及脑组织炎症水平，改善脑组织的炎症微环境，从而减轻脑组织的病理损伤及缺血带来的神经功能障碍，起到对脑缺血损伤的保护作用，miRNA-126为治疗脑缺血再灌注引起的炎性反应提供新思路。