筋骨痛消丸对膝骨关节炎大鼠模型血清MLT、MMP-3、MMP-13的影响

王若旭 刘 源 李 峰 郭珈宜 郭艳幸

（1 佛山健翔医院，广东 佛山 528000；2 湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；3 河南省洛阳正骨医院，河南 洛阳 471000）

膝关节骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种退行性骨关节疾病，以膝关节肿痛、活动受限为主要临床表现[1-2]，是中老年人致残的主要病种[3]。筋骨痛消丸临床用于治疗膝骨关节炎疗效显著，未见不良反应报道。在目前实验研究报道中，已证实筋骨痛消丸可以降低血清和滑膜组织中IL-1β、TNF-α的表达水平[4-6]。本实验通过探究筋骨痛消丸对膝骨关节炎大鼠模型血清中MLT、MMP-3及MMP-13表达水平的影响，从分子生物学水平有效阐明筋骨痛消丸治疗膝骨关节炎的机制，提供实验数据及理论依据，进而指导临床运用。

1 材料与方法

1.1 动物分组：取40只SPF级SD大鼠，体质量200～220 g，雌雄各半（合格证号：SCXK（豫）2017-0001），购自河南省实验动物中心，将其随机平均分配成4组：空白对照组、模型对照组、阳性对照组、实验组，每组10只。各组大鼠分笼饲养于河南省正骨研究院实验室，光线及通风良好，自由饮水摄食。

1.2 药品：根据临床等效剂量人与大鼠给药剂量比值为1∶6.17作为大鼠给药剂量[7]（其中正常人所需剂量按60 kg体质量计算）。

1.2.1 双醋瑞因胶囊（昆明积大制药股份有限公司，批号：国药准字J20150097）：在河南省正骨研究院实验室进行药液制备，将胶囊包衣祛除后，保留粉状药物，称重0.072 g，配以生理盐水至140 mL，充分搅拌，制成药液。

1.2.2 筋骨痛消丸（河南省洛正药业有限责任公司，批号：国药准字Z10970117）：在河南省正骨研究院实验室进行中药液制备，将药丸碾成粉状后，称重25.914 g，配以生理盐水至140 mL，充分搅拌，制成中药液。

1.2.3 木瓜蛋白酶（Beijing Solarbio Science &Technology Co.,Ltd，批号：1224H021）：称重1.68 g粉状木瓜蛋白酶，配以生理盐水至42 mL混合，搅拌均匀，得到浓度为4%的木瓜蛋白酶溶液。

1.2.4 水合氯醛（Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd，批号：C10323758）：将块状水合氯醛碾成粉状后，称重20.00 g，加生理盐水至200 mL混合，搅拌均匀，得到浓度为10%的水合氯醛溶液。

1.3 主要仪器。ELISA试剂盒：艾莱萨生物科技(上海)有限公司，试剂盒号：E20190201A；电子天平：日本AND公司；移液器：德国艾本德股份公司；酶标仪：北京普朗新技术有限公司；培养箱：上海精宏实验设备公司。

1.4 方法

1.4.1 大鼠膝骨关节炎模型的建立：适 应性喂养3 d后造模。除空白对照组外，其余各组大 鼠均采用Panicker[8]造模法：无菌条件下抽取0.2 mL 4%木瓜蛋白酶溶液，将大鼠固定后，屈曲右侧膝关节约45°，局部采取碘伏消毒后，从髌骨下极髌韧带外侧向髁间窝方向进针，出现落空感时即进入关节腔，关节腔内注射0.2 mL木瓜蛋白酶溶液，注射完毕后屈伸活动该膝关节，使溶液在关节腔内充分扩散。每2天注射1次，连续注射两周，即制得膝关节骨关节炎大鼠模型。

1.4.2 药物干预：完成造模后，次日起进行药物干预。阳性对照组大鼠每天予以0.1 mL/10 g双醋瑞因药液给药；实验组每天予以0.1 mL/10 g筋骨痛消丸药液给药，空白对照组及模型对照组每天予以0.1 mL/10 g生理盐水给药。各组每天给药1次，连续2周。

1.4.3 标本采集：各组大鼠末次给药后4 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，采用心尖取血法采集样本：固定大鼠，除毛，局部碘伏消毒，手指触及大鼠心尖搏动最明显处进针，垂直刺入心脏，抽取血液。每只大鼠取约2 mL血液置于试管，离心收集血清约1 mL，置于-70 ℃保存待测。

1.4.4 检测指标及方法

1.4.4.1 关节肿胀度：药物干预前及干预后，剔除大鼠右膝关节被毛，确定右侧髌骨位置后，以髌中为测量起止点，以黑色记号笔标注大鼠右膝关节周径，然后测量标记处黑色长度，即肿胀度，测量3次后计算得出平均值并进行记录。

1.4.4.2 血清中MLT、MMP-3、MMP-13含量检测：采用ELISA 法检测MLT、MMP-3及MMP-13的含量，具体步骤严格按照ELISA试剂盒使用说明书进行操作。

1.4.5 统计方法处理：采用 SPSS20.0统计软件进行数据分析与处理。定量资料用“均数±标准差”表示，若满足正态性及方差齐性，运用单因素方差分析；若不满足，则可采用秩和检验。检验标准α=0.05，P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠膝关节肿胀度（周径）：药物干预后，与模型对照组相比，阳性对照组和实验组大鼠右膝关节的肿胀度均显著降低（P＜0.05），实验组大鼠右膝关节的肿胀度较阳性对照组的明显降低（P＜0.05），见表1。

2.2 大鼠血清中MLT、MMP-3、MMP-13的表达水平：药物干预后，与空白对照组对比，其余各组大鼠血清中MLT、MMP-3、MMP-13的表达水平均增高（P＜0.05），与模型对照组和阳性对照相比，实验组大鼠血清中MLT的表达水平显著升高（P＜0.05）；与模型对照组相比，阳性对照组和实验组大鼠血清中的MMP-3、MMP-13表达水平均降低（P＜0.05），与阳性对照组相比，实验组大鼠血清中的MMP-3、MMP-13表达水平更低（P＜0.05），见表2。

表1 各组大鼠肿胀度（周径）（±s）

表1 各组大鼠肿胀度（周径）（±s）

注：与空白对照组相比，*P＜0.05；与模型对照组相比，★P＜0.05；与阳性对照组相比，＃P＜0.05；n=10

表2 各组大鼠血清中MLT、MMP-3、MMP-13表达水平（±s）

表2 各组大鼠血清中MLT、MMP-3、MMP-13表达水平（±s）

注：与空白对照组相比，*P＜0.05；与模型对照组相比，★P＜0.05；与阳性对照组相比，＃P＜0.05；n=10

3 讨论

据报道[9-10]，部 分中药复方可通过调节脏腑功能进而调节机体褪黑素（MLT）水平，以防治疾病。筋骨痛消丸是国家级非物质文化遗产“平乐郭氏正骨”的传统方，由洛阳平乐郭氏正骨第六代传人郭维淮名老中医采用丹参、鸡血藤、香附(醋制)、乌药、川牛膝、桂枝、威灵仙、秦艽、白芍、地黄、甘草等11味中药组方而成，具有温经通络、行气活血、消肿止痛之功效，临床用于治疗KOA疗效显著，未见不良反应报道。

KOA与MLT、MMP-3、MMP-13的表达水平关系密切。研究表明，基质金属蛋白酶（MMPs）在软骨组织中过量表达，会降解关节软骨基质，是引发OA的主要原因[11-13]。MMP-3和MMP-13被广泛认为与OA关节软骨病理性降解密切相关[14-16]。MLT是一种具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等多种生物活性的神经内分泌激素，主要由松果体分泌[17-18]。Lim等[19]认为MLT通过参与炎症和氧化应激的SIRT 1通路，对人软骨细胞具有保护作用。研究表 明，MLT能降低TNF-α、IL-1β、PGE2和NO等炎性介质在软骨细胞中的表达水平，抑制炎症引起的MMP-3和MMP-13产生，对KOA产生积极作用[20]。

本实验KOA模型大鼠血清中MMP-3、MMP-13的表达水平增高，关节软骨降解破坏。实验组大鼠血清中MLT表达水平显著升高，MMP-3、MMP-13的表达 水平降低明显。表明，筋骨痛消丸可以提升KOA大鼠模型血清中MLT 的表达水平，降低MMP-3、MMP-13的表达水平，说明筋骨痛消丸可以增强抗氧化、抗凋亡及抗炎等作用，抑制关节软骨的降解破坏，对KOA的治疗产生积极作用。