微生物-石墨烯联合强化畜禽养殖废水处理研究

张 超，李 静，宋志斌，白 洁，胡丽君，公衍丽，吴 迪，陈峻峰，刘 凯

（曲阜师范大学生命科学学院，山东曲阜273165）

畜禽养殖废水具有COD、氮、磷、悬浮物（SS）以及致病菌含量高并伴有恶臭、水质水量变化大、处理难度大等特点。对于这类复合污染水体，如果不进行合理的处置，直接外排将会对周边环境造成严重的污染，甚至严重威胁人体的健康〔1〕。

我国传统的畜禽养殖废水处理方式主要有自然处理法、生物处理法、物化处理法等〔2〕。自然处理法占地面积大，容易受到外部环境变化的不良影响，而且存在污染地下水的风险〔3〕；生物处理法受水质、水量的影响较大，且对废水浓度有一定的要求〔4〕；物化处理法对于畜禽养殖废水中COD、氨氮、重金属均有一定的去除能力，但作为单独处理工艺，净化效果尚有欠缺，不适用于大规模的废水处理〔5〕。

针对上述情况，本研究以黄假单胞菌Pseudomonas flavaWD-3与氧化石墨烯（GO）构建微生物-纳米材料联合处理体系的新思路。其中，Pseudomonas flavaWD-3是从山东省南四湖人工湿地中分离筛选出来的耐性菌，在低温条件下仍可对人工湿地废水中的COD以及氮、磷等营养物质具有明显的去除效果，平均去除效率分别为未投加该菌的 1.5～1.8倍〔6〕，在污水治理中具有良好的应用前景和很大的发展空间。同时，近年来石墨烯材料以其独特的二维结构和优异的性能在水处理等领域的应用引起了学者的广泛关注〔7〕。GO作为石墨烯的重要派生物，其表面含有丰富的含氧官能团，具有性质稳定、比表面积高（2 630 m2/g）、亲水性强、表面易于进行功能化以及可实现循环利用等优点〔8〕，而且价格较石墨烯相对便宜，被认为是水处理技术的理想材料，具有重要的科研价值和广阔的发展前景。

本研究通过在常温条件下向猪场养殖废水中投加Pseudomonas flavaWD-3菌悬液和GO溶液，获得了其最佳的投加比例，原位制得了石墨烯纳米颗粒，同步考察了废水中COD、NH4+-N、TN、TP的变化，以Pseudomonas flavaWD-3和GO单一处理体系作参比，探究了微生物-纳米材料联合体系对畜禽养殖废水的处理效果、作用周期和去除机理，为畜禽养殖废水处理提供了新思路，对农业面源污染控制和水环境生态治理具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1Pseudomonas flavaWD-3菌悬液的制备

接种4℃斜面保存的Pseudomonas flavaWD-3菌株于30℃下活化24 h后，转接至100 mL的LB液体培养基中于22～25℃恒温振荡培养至对数生长期 （24～36 h）， 然后在22℃、3 000 r/min下进行离心，去除培养基中的营养成分。收集菌体细胞，取湿菌体细胞置于无菌水中制备成菌悬液，在600 nm波长下其吸光度为1.0～1.2，菌悬液的浓度为4.575×108mL-1〔9〕。

1.1.2 GO溶液的制备

石墨的预处理：在圆底烧瓶内，将50 mL浓硫酸加热到90℃，连续搅拌（250 r/min），缓慢依次少量分别加入10 g过硫酸钾和10 g五氧化二磷，至完全溶解。混合物冷却至80℃。在剧烈搅拌下（400 r/min），缓慢加入12 g石墨，在80℃下反应5 h。反应结束后停止加热并冷却至室温，将圆底烧瓶内物质转移至大烧杯中，加入2 L去离子水稀释，静置12 h以上。将上清液倒出，抽滤洗涤至滤液呈中性。将固体转移至培养皿中，置于鼓风干燥箱中100℃下干燥12 h以上。取出样品冷却至室温后，将其存放于真空干燥器中。

GO 溶液的制备：采用改进 Hummers法〔10〕。 将100 mL冰的浓硫酸加入至圆底烧瓶。在10℃下，取3 g预处理的石墨加入至冰的浓硫酸中搅拌均匀，将15 g高锰酸钾在剧烈搅拌下缓慢加入至冰的浓硫酸中，密切监控水浴温度不超过10℃。加完高锰酸钾后，整个混合物在50℃下反应2 h。反应结束后，将混合物缓慢倒入装有200 g冰块的烧杯中，边缓慢搅拌边加入，防止其局部温度过高。将此混合物搅拌2 h，再加入2 L去离子水稀释，后加入12 mL双氧水。搅拌完全后静置24 h，倒去上清液。用10%的盐酸溶液洗涤样品，直到样品溶液离心后的上清液加入BaCl2后不会产生白色沉淀为止。然后用水离心处理至中性，加入一定量的去离子水，超声剥离后即为GO。将其配制成不同浓度，冷冻保藏备用。

1.1.3 实验水样的确定

量取少量从养殖场获得的猪场养殖废水经自然沉淀后分别稀释10倍、20倍、50倍、100倍，控制pH为7左右，测定COD，最终确定50倍稀释水样（COD为500 mg/L左右）作为实验水样。

1.2 实验方法

1.2.1PseudomonasflavaWD-3菌悬液处理废水研究

根据唐美珍等〔11〕的研究，选定投菌量即V（菌悬液）/V（水样）为1.5%～10%。在常温条件下，首先设置1.5%、4%、6%、8%、10%5个梯度，分别配制3 L水样处理系统，以投加菌悬液0 h（刚加入菌悬液）时废水水样中COD、NH4+-N、TN、TP的质量浓度做参比，每隔24 h进行取样测定，追踪各污染物质量浓度变化，获得该梯度设置下的最佳投菌量和作用效果趋势。然后以该投菌量为中心缩小梯度范围，重复上述实验内容，获得PseudomonasflavaWD-3对养殖废水中各污染物的去除率和最佳投菌量作用周期。

1.2.2Pseudomonas flavaWD-3菌悬液与GO溶液最佳投加比例探究

常温条件下，同时投加所得最佳投菌量的Pseudomonas flavaWD-3菌悬液与GO溶液于水样中获得0、0.5、1.0、1.5 mg/L不同GO溶液浓度梯度的3 L水样处理系统，以投加菌悬液与GO溶液0 h时废水水样中COD、NH4+-N、TN、TP的质量浓度做参比，每隔24 h进行取样测定，追踪水样处理系统中各污染物质量浓度的变化，分析获得二者的最佳投加比例，确定为后续实验的联合处理体系。

1.2.3Pseudomonas flavaWD-3-GO联合体系处理废水研究

保持前期实验条件不变，将上一阶段所得联合体系加入3 L水样处理系统中，以相同投加量的Pseudomonas flavaWD-3和GO单一处理体系作参比，考察水样中 COD、NH4+-N、TN、TP的变化，获得该联合体系对养殖废水的处理效果和作用周期。通过对实验获得的石墨烯与所用GO进行X射线衍射和拉曼光谱分析以及对所得石墨烯进行电镜扫描分析，探究联合体系对养殖废水的去除机理。

1.2.4 水质指标的测定方法

总氮的测定采用碱性过硫酸钾紫外分光光度法；氨氮的测定采用纳氏试剂分光光度法；COD的测定硫酸亚铁铵滴定法；总磷的测定采用钼酸铵分光光度法。各指标测定的具体操作步骤详见《水和废水监测分析方法》（第4版）。

2 结果与结论

2.1 Pseudomonas flava WD-3对污染物的去除效果和最佳投菌量的作用周期

通过对1.5%、4%、6%、8%、10%5个梯度Pseudomonas flavaWD-3处理体系中4种污染物的连续追踪测定，发现8%的Pseudomonas flavaWD-3菌悬液对水样处理效果较前3个梯度更加明显并且接近甚至超过10%处理体系，因此再次设置了6%、7%、8%、9%、10%5个梯度，进行重复实验，最终得到了不同梯度Pseudomonas flavaWD-3的菌悬液对养殖废水中各污染物的最大去除率，结果见表1。

表1 4种污染物的进水参数和不同梯度菌悬液处理体系的最大去除率

由表1可知，随着投菌量的增加，4种污染物的去除率基本呈上升趋势；投菌量为6%～7%时，去除率均有明显的增加（TP最为明显），而由7%到10%各污染物的去除率相差不大，综合考虑各方面因素，确定最佳投菌量为7%，对水样中COD、NH4+-N、TN、TP的去除率分别为25.72%、19.98%、21.76%、27.66%。

通过连续1周的追踪测定，获得了7%Pseudomonas flavaWD-3菌悬液处理体系中4种污染物的变化趋势，结果见图1。

图1 菌悬液处理体系中污染物的去除效果

由图1可知，随着时间的延长，各污染物的质量浓度呈先下降后上升的趋势，在第2 d或第3 d降至最低，即去除率达到最大，3 d后质量浓度开始明显上升。因此，在单一菌悬液处理体系中选作用周期为3 d为宜。

2.2 Pseudomonas flava WD-3菌悬液与GO溶液的最佳投加比例

保持Pseudomonas flavaWD-3 7%的最佳投菌量不变，向废水中投加不同浓度梯度的GO溶液，考察4种污染物的最大去除率，结果见图2。

图2 不同浓度GO溶液对各污染物去除效果的影响

由图2可知，随着GO溶液浓度的增加，对COD、NH4+-N、TN、TP的最大去除率呈上升趋势，当GO溶液质量浓度达到1.0 mg/L之后，继续增大GO溶液质量浓度至1.5 mg/L，其最大去除率变化不大。因此，综合考虑去除率、处理成本等因素，最终确定联合体系的最佳投加比例为7%的Pseudomonas flavaWD-3菌悬液和1 mg/L的GO溶液。

2.3 联合体系对养殖废水的处理效果和作用周期

以Pseudomonas flavaWD-3和GO单一处理体系作参比，考察7%Pseudomonas flavaWD-3菌悬液与1 mg/L GO溶液联合体系对养殖废水中4种污染物的去除效果，结果见图3。

图3 不同处理体系对4种污染物的去除效果

由图3可知，在1～2 d，由于GO对微生物的抑制作用〔12〕，联合体系对各污染物的去除率接近甚至低于GO单一处理体系；在2～3 d，Pseudomonas flavaWD-3逐渐适应环境，并且通过菌株自身及其所产生的酶在电子介质的作用下将GO原位还原形成了石墨烯〔13〕，同时由于还原GO表面有丰富的π电子结构，更易于π-π共轭键的形成，进一步提高了联合体系对污染物的吸附降解作用〔14〕，使得该体系在第3 d对COD、NH4+-N、TN、TP的去除率达到最大，分别为 82.24%、56.06%、57.73%、70.00%，为仅投加Pseudomonas flavaWD-3菌悬液（25.72%、19.98%、21.76%、27.66%）的 3.17、2.74、2.95、3.19 倍和仅投加 GO 溶液（58.44%、34.53%、32.26%、44.41%）的1.42、1.59、1.62、1.58 倍，达到了“1+1＞2”的处理效果，同时出水满足畜禽养殖业污染物排放标准（GB 18596—2001）；而在 4～6 d，联合体系对各污染物的去除率逐渐下降并且趋于稳定，处理效果仍然高于GO单一处理体系，由此推测在第3 d，联合处理体系中可能存在2种共存情况：Pseudomonas flavaWD-3和还原氧化石墨烯（rGO）共存或Pseudomonas flavaWD-3、GO、rGO三者共存。综合考虑时间及实验成本等问题，选用3 d为作用周期。

2.4 联合体系对养殖废水的去除机理

Pseudomonas flavaWD-3原位还原GO结构和形貌特征分析见图4。

图4 Pseudomonas flava WD-3原位还原GO的结构和形貌特征分析

图4 （a）是GO和石墨烯的XRD图谱，GO的峰值出现在 10.5°（〔001〕晶面），而石墨烯的此峰消失，而在26.6°和32.7°出现了相对明显的峰，这与J.Chen等〔15〕采用混合微生物原位还原结果类似，表明GO大部分被Pseudomonas flavaWD-3原位还原。

图 4（b）是 GO和石墨烯的拉曼光谱图，在1 342 cm-1处的D峰反映的是碳原子sp3杂化结构，反映石墨烯的缺陷度和混乱度，在1 582 cm-1处的G峰反映的是碳原子sp2杂化结构的伸缩振动。D峰和G峰强度比（ID/IG）可以用来表征石墨烯的石墨化程度或无序化程度。图4（b）中GO和石墨烯的ID/IG从0.76增加到0.94，这表明经Pseudomonas flavaWD-3原位还原得到的石墨烯的无序程度增大，石墨烯内部可以提供更多的缺陷位点，ID/IG的增大也可说明石墨烯π-π共轭状态得以扰乱〔16〕。

图4（c）是石墨烯的SEM图，可以观察到石墨烯具有明显的层状结构，随机堆叠，出现褶皱和弯曲的形貌结构，这是由于其含氧官能团的减少，使得石墨烯层与层之间因范德华力的作用而易于团聚，石墨烯的这种堆叠方式利于增大其比表面积。

图4（d）是石墨烯的TEM图，可以看出石墨烯呈透明片状结构，表面平滑，边缘具有褶皱，微生物还原所得石墨烯是单层或少层的，其厚度约为1 nm。

GO被PseudomonasflavaWD-3成功还原是由于养殖废水在厌氧条件下被Pseudomonas flavaWD-3代谢，在微生物胞内进行氧化还原反应产生还原产物和氧化产物，电子受体间接或直接地接收糖酵解和细胞呼吸作用产生的还原型辅酶（NADH）所携带的电子后生成还原产物，在此过程中会产生还原力或还原作用氧化。在这一过程中不仅Pseudomonas flavaWD-3会利用养猪废水中的碳氮磷等物质合成自身所需营养物质，且还原过程也需消耗废水中的营养成分，进而使得水体中COD、NH4+-N、TN、TP的处理效果得以提升；图4表明经Pseudomonas flavaWD-3还原后的石墨烯具有与化学还原法得到相类似的结构，可以充分发挥石墨烯自身的催化能力协同Pseudomonas flavaWD-3强化对养殖废水的处理效果；且石墨烯具有巨大的比表面积使其具有很强的吸附能力，使得养殖废水中的COD、NH4+-N、TN和TP得以进一步去除。

3 结论

（1）Pseudomonas flavaWD-3单一体系处理养殖废水的最佳投菌量为7%，此时Pseudomonas flavaWD-3对水样中 COD、NH4+-N、TN、TP的去除率分别为25.72%、19.98%、21.76%、27.66%，作用周期为 3 d。

（2）联合体系的最佳投加比例为7%的Pseudomonas flavaWD-3菌悬液和1 mg/L的GO溶液，对COD、NH4+-N、TN、TP的最大去除率分别为82.24%、56.06%、57.73%、70.00%，为仅投加Pseudomonas flavaWD-3 菌悬液的 3.17、2.74、2.95、3.19 倍和仅投加GO 溶液的 1.42、1.59、1.62、1.58 倍。

（3）7%的Pseudomonas flavaWD-3菌悬液和 1 mg/L GO联合体系对养殖废水的作用周期为3 d，此时废水中COD、NH4+-N、TN和TP去除率达到最大值，同时出水满足畜禽养殖业污染物排放标准（GB 18596—2001）。

（4）GO大部分被Pseudomonas flavaWD-3成功原位还原，所得石墨烯与化学还原所得石墨烯的性能接近，石墨烯具协同Pseudomonas flavaWD-3强化养殖废水处理效果，且石墨烯具有很强的吸附能力，使得养殖废水中的COD、NH4+-N、TN和TP得以高效去除。