成年烟雾病患者血清血管细胞黏附分子1、基质金属蛋白酶9、转化生长因子β、血管内皮生长因子水平变化及其临床意义研究

陈捷，程亚玲，陈海燕，官念

烟雾病（moyamoya disease，MMD）是导致脑卒中反复发作的主要原因之一，病理学上可分为出血和缺血两种分型。目前MMD的病因及发病机制尚不完全明确，且此类患者通常在发生脑血管事件后才被确诊，此时，部分患者可能已发生不可逆的脑损伤［1］。血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion factor-1，VCAM-1）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）在体内多种生物学改变中扮演重要角色，尤其在受损的心血管及炎性细胞中较高［2］。研究表明，血管增生相关因子中较为常见的转化生长因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可促进 VCAM、MMP水平升高及新生血管形成，还具有保护、营养神经的作用［3-4］。目前关于上述指标的作用机制研究主要集中于脑出血、脑梗死等，而在MMD中的作用及与病理类型、病情程度、预后的关系少有报道。本研究旨在探讨成年MMD患者血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平及其临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年3月—2019年1月四川大学华西广安医院收治的成年MMD患者114例作为病例组，均符合MMD的诊断标准［5］，并经数字减影血管造影检查确诊，其中缺血型68例和出血型46例；另选取同期在本院体检中心体检健康者30例作为对照组。纳入标准：（1）年龄≥18周岁；（2）积极配合相关检查与随访，临床资料完整。排除标准：（1）明确诊断由动脉粥样硬化、脑膜炎、脑肿瘤、颅脑创伤、颅脑放射性损伤及自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮、结节性周围动脉炎、干燥综合征等）引起的类似“烟雾血管”变化者；（2）合并高血压及心、肺、肝、肾功能不全者。对照组受试者中男19例，女11例；年龄18～70岁，平均年龄（42.9±10.2）岁。病例组患者中男69例，女45例；年龄29～70岁，平均年龄（43.9±9.7）岁。对照组与病例组受试者性别（χ2=0.079）、年龄（t=0.497）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。缺血型患者中男39例，女29例；年龄29～68岁，平均年龄（44.1±10.7）岁；Suzuki分级［6］：2级（大脑前、中动脉扩张，颈内动脉少量新生血管）9例，3级（大脑前、中动脉受累，颈内动脉大量新生血管）20例，4级（颈内动脉狭窄或闭塞性病变加重）20例，5级（大脑前、中动脉完全未见显影）11例，6级（前循环血液完全由额外动脉供应）8例；合并症：高血压14例，糖尿病7例；有吸烟史23例；治疗方式：保守治疗31例，手术治疗37例。出血型患者中男30例，女16例；年龄31～70岁，平均年龄（43.6±9.4）岁；Suzuki分级：2级8例，3级11例，4级14例，5级7例，6级6例；合并症：高血压14例，糖尿病7例；有吸烟史19例；治疗方式：保守治疗19例，手术治疗27例。缺血型与出血型患者性别（χ2=0.710）、年龄（t=0.257）、Suzuki分级（u=0.002）、高血压发生率（χ2=1.436）、糖尿病发生率（χ2=0.617）、吸烟史（χ2=0.660）及治疗方式（χ2=0.205）比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经四川大学华西广安医院医学伦理委员会审核批准，所有患者对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 治疗方法 所有MMD患者入院确诊后建议手术治疗，并告知不同治疗方式可能出现的短、长期风险，根据患者意愿选择治疗方式。保守治疗包括阿司匹林（拜耳医药保健有限公司生产，生产批号：150603、171006、180702）0.1 g/d、阿托伐他汀片（广东百科制药有限公司生产，生产批号：160122、171211）20 mg/d、尼莫地平（四川豪运药业股份有限公司生产，生产批号：151223、180315）60 mg/d，若出现药物相关不良反应则改换同种类其他药物或停止服用。手术治疗分为单侧手术及双侧序贯手术，均由有丰富经验的医护团队进行。

1.3 观察指标 病例组患者分别于入院第1天、第7天和第14天抽取空腹肘正中静脉血5 ml，静置30 min，于4℃3000 r/min离心10 min（离心半径15 cm）后取上层血清并置于-80 ℃冰箱待测，采用酶联免疫吸附试验检测血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平，试剂盒购自上海酶研生物科技有限公司，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。对照组受试者于体检当日抽取空腹肘正中静脉血，具体操作步骤同病例组。

1.4 统计学方法 以SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。计量资料以（± s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；重复测量资料比较采用双因素重复测量方差分析；计数资料比较采用χ2检验；血清VCAM-1、MMP-9水平与血清TGF-β、VEGF水平的相关性分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组与病例组受试者血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平比较 病例组患者入院第1天血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平高于对照组（体检当日），差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

表1 对照组与病例组受试者血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平比较（± s）Table 1 Comparison of serum levels of VCAM-1，MMP-9，TGF-β and VEGF between control group and case group

表1 对照组与病例组受试者血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平比较（± s）Table 1 Comparison of serum levels of VCAM-1，MMP-9，TGF-β and VEGF between control group and case group

注：VCAM-1=血管细胞黏附分子1，MMP-9=基质金属蛋白酶9，TGF-β=转化生长因子β，VEGF=血管内皮生长因子

组别 例数 V C A M-1（n g/L） M M P-9（μ g/L） T G F-β（n g/L） V E G F（n g/L）对照组 3 0 2 5.5±5.8 5 9.2±1 3.0 3 8.4±6.2 5 1.9±1 1.6病例组 1 1 4 1 8 7.2±2 7.1 2 9 9.7±5 8.7 6 4.9±1 6.3 1 7 6.6±3 3.7 t值 3 2.4 3 0 2 2.2 2 4 8.7 3 8 1 9.8 9 2 P值 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1

2.2 缺血型与出血型患者不同时间点血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平比较 时间与方法在血清VCAM-1、MMP-9水平上不存在交互作用（P＞0.05），在血清TGF-β、VEGF水平上存在交互作用（P＜0.05）；时间在血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平上主效应显著（P＜0.05）；方法在血清VCAM-1、MMP-9水平上主效应不显著（P＞0.05），在血清TGF-β、VEGF水平上主效应显著（P＜0.05）。出血型患者入院第1天、第7天、第14天血清TGF-β、VEGF水平高于缺血型患者，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.3 不同Suzuki分级患者入院第1天血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平比较 不同 Suzuki分级缺血型和出血型患者入院第1天血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。Suzuki分级3级缺血型患者血清MMP-9、VEGF水平高于Suzuki分级2级患者，Suzuki分级3级出血型患者血清VEGF水平高于Suzuki分级2级患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；Suzuki分级4级缺血型、出血型患者血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平分别高于Suzuki分级2、3级缺血型、出血型患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；Suzuki分级5、6级缺血型、出血型患者血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平分别高于Suzuki分级2、3、4级缺血型、出血型患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；Suzuki分级6级缺血型、出血型患者血清VEGF水平分别高于Suzuki分级5级缺血型、出血型患者，差异有统计学意义（P＜0.05，见表 3～4）。

2.4 缺血型和出血型患者入院第1天血清VCAM-1、MMP-9水平与血清TGF-β、VEGF水平的相关性分析 Pearson相关分析结果显示，缺血型、出血型患者入院第1天血清VCAM-1、MMP-9水平分别与血清TGF-β、VEGF水平呈正相关（P＜0.05，见表5～6）。

表2 缺血型与出血型患者不同时间点血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平比较（±s）Table 2 Comparison of serum levels of VCAM-1，MMP-9，TGF-β and VEGF between patients with ischemic type and hemorrhagic type at different time points

表2 缺血型与出血型患者不同时间点血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平比较（±s）Table 2 Comparison of serum levels of VCAM-1，MMP-9，TGF-β and VEGF between patients with ischemic type and hemorrhagic type at different time points

注：MMD=烟雾病；与缺血型比较，aP＜0.05

M M D类型 例数 V C A M-1（n g/L） M M P-9（μ g/L）入院第1天 入院第7天 入院第1 4天 入院第1天 入院第7天 入院第1 4天缺血型 6 8 1 8 4.6±2 6.6 1 3 6.1±2 7.7 7 8.4±1 4.4 2 9 5.1±5 3.5 2 3 3.1±5 2.8 1 6 9.2±2 3.6出血型 4 6 1 9 0.6±2 6.9 1 3 8.8±2 5.4 8 1.5±1 4.2 3 0 5.4±6 0.7 2 4 5.6±5 3.4 1 7 6.6±2 7.8 F值 F时间=3 2.1 1 6，F组间=0.6 5 8，F交互=0.7 5 7 F时间=2 9.7 4 5，F组间=1.3 8 6，F交互=0.9 4 2 P值 P时间＜0.0 0 1，P组间=0.6 3 1，P交互=0.5 3 6 P时间＜0.0 0 1，P组间=0.1 3 7，P交互=0.3 5 0 M M D类型 T G F-β（n g/L）V E G F（n g/L）入院第1天 入院第7天 入院第1 4天 入院第1天 入院第7天 入院第1 4天缺血型 5 8.4±1 5.1 4 2.1±1 1.0 3 5.0±7.3 1 6 2.5±2 8.2 1 3 6.4±2 3.3 1 0 7.9±2 3.2出血型 7 2.7±1 5.7 a 5 8.6±1 2.3 a 4 9.3±8.2 a 1 9 0.7±3 5.4 a 1 7 2.3±3 3.2 a 1 5 5.1±2 4.2 a F 值 F时间=1 7.6 0 9，F组间=1 9.5 5 7，F交互=3.5 6 4 F时间=1 4.3 4 1，F组间=1 6.7 2 4，F交互=3.2 7 7 P 值 P时间＜0.0 0 1，P组间＜0.0 0 1，P交互=0.0 0 1 P时间＜0.0 0 1，P组间＜0.0 0 1，P交互=0.0 0 2

表3 不同Suzuki分级缺血型患者入院第1天血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平比较（± s）Table 3 Comparison of serum levels of VCAM-1，MMP-9，TGF-β and VEGF in ischemic type patients with different Suzuki grades

表3 不同Suzuki分级缺血型患者入院第1天血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平比较（± s）Table 3 Comparison of serum levels of VCAM-1，MMP-9，TGF-β and VEGF in ischemic type patients with different Suzuki grades

注：与Suzuki分级2级比较，aP＜0.05；与Suzuki分级3级比较，bP＜0.05；与Suzuki分级4级比较，cP＜0.05；与Suzuki分级5级比较，dP＜0.05

Suzuki分级 例数 VCAM-1（ng/L） MMP-9（μg/L） TGF-β（ng/L） VEGF（ng/L）2级 9 142.1±21.0 207.1±30.9 42.5±9.9 78.4±13.1 3级 20 159.0±24.3 251.3±30.4a 49.9±10.7 115.3±20.8a 4级 20 183.5±29.8ab 297.6±32.3ab 60.0±14.8ab 163.7±30.7ab 5级 11 215.5±37.9abc 339.3±40.2abc 71.4±16.4abc 188.6±27.2abc 6级 8 247.7±44.3abc 358.0±46.2abc 84.8±18.3abc 229.4±36.9abcd F值 18.856 32.174 14.236 49.831 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表4 不同Suzuki分级出血型患者入院第1天血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平比较（± s）Table 4 Comparison of serum levels of VCAM-1，MMP-9，TGF-β and VEGF in hemorrhagic type patients with different Suzuki grades

表4 不同Suzuki分级出血型患者入院第1天血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平比较（± s）Table 4 Comparison of serum levels of VCAM-1，MMP-9，TGF-β and VEGF in hemorrhagic type patients with different Suzuki grades

注：与Suzuki分级2级比较，aP＜0.05；与Suzuki分级3级比较，bP＜0.05；与Suzuki分级4级比较，cP＜0.05；与Suzuki分级5级比较，dP＜0.05

S u z u k i分级 例数 V C A M-1（n g/L） M M P-9（μ g/L） T G F-β（n g/L） V E G F（n g/L）2级 8 1 4 9.4±2 1.9 2 1 7.4±3 6.3 4 2.7±8.9 8 4.3±1 4.9 3级 1 1 1 6 0.2±2 4.7 2 5 3.3±3 5.6 5 0.3±1 0.7 1 2 1.3±2 4.6 a 4级 1 4 1 9 0.9±3 0.0 ab 3 1 0.4±3 5.1 ab 6 2.6±1 5.0 ab 1 7 1.1±3 4.3 ab 5级 7 2 2 4.1±3 8.8 abc 3 4 5.3±3 7.4 abc 7 4.4±1 7.0 ab 1 9 7.4±3 2.8 ab 6级 6 2 5 2.2±4 9.2 abc 3 6 7.3±4 8.3 abc 8 9.3±1 8.5 abc 2 4 2.4±4 6.7 abcd F值 1 3.1 5 1 2 1.1 5 3 1 2.7 1 5 2 8.0 2 3 P值 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1

表5 缺血型患者入院第1天血清VCAM-1、MMP-9水平与血清TGF-β、VEGF水平的相关性Table 5 Correlations of serum level of VCAM-1，MMP-9 with serum level of TGF-β，VEGF in patients with hemorrhagic type

表6 出血型患者入院第1天血清VCAM-1、MMP-9水平与血清TGF-β、VEGF水平的相关性Table 6 Correlations of serum level of VCAM-1，MMP-9 with serum level of TGF-β，VEGF in patients with ischemic type

3 讨论

MMD是一类少见的脑血管疾病，又称为“脑底异常血管网病”，其主要表现为双侧颈内动脉及其主要侧支内膜缓慢增厚、动脉管腔逐渐狭窄甚至闭塞，狭窄部位伴有异常增生的血管网形成等，由于异常增生的血管网在脑血管造影时呈现烟雾状，故命名为MMD［7］。临床上将MMD分为两种类型，即管腔扩张、管壁相对薄的出血型MMD和管壁增厚伴管腔狭窄的缺血型MMD。据统计，约50%的成年MMD表现为颅内出血，且出血型MMD患者再出血风险、致残率、病死率均高于缺血型MMD患者［8］。目前，MMD患者颅内出血原因分析主要基于其临床特点及影像学特点，其可能与合并颅内动脉瘤破裂、异常增生的烟雾状血管破裂、脉络膜前动脉破裂及合并动静脉畸形破裂有关［9］。

研究表明，VCAM-1常被用于动脉粥样硬化的辅助诊断及评估，并与斑块体积、斑块炎性反应、纤维帽变薄及管腔狭窄程度等均有密切关系［10-11］。VCAM-1属于免疫球蛋白超家族成员，且已有学者发现MMD患者脑脊液中VCAM-1和内皮细胞选择素水平异常升高［12］。MMP-9属于基质金属蛋白酶（MMP）家族的重要成员，具有调节细胞外基质降解、重塑的生理作用，被激活后可降解细胞外基质的多种有效成分，破坏其正常结构，并可促使斑块的纤维帽变薄、冠状动脉易损斑块破裂，最终诱发心脑血管事件发生［13-14］。近年有研究显示，MMD患者血清MMP-9水平高于健康者［15］；张皆德等［16］研究表明，血清MMP-9水平升高可能使内皮祖细胞活化及迁移，从而参与异常烟雾血管的发生及形成，与SONOBE等［17］观点类似。暴向阳等［18］研究表明，MMD患者受累动脉内可发现T淋巴细胞及巨噬细胞浸润，且包括VCAM-1在内的内皮细胞黏附分子可能也参与此病理过程；BLECHARZ-LANG等［19］研究表明，MMP可降解脑血管基底膜和细胞外基质成分，并通过蛋白水解参与血-脑脊液屏障的破坏、脑水肿和MMD等多种病理生理过程。本研究结果显示，病例组患者入院第1天血清VCAM-1、MMP-9水平高于对照组（体检当日），表明成年缺血型与出血型MMD患者血清VCAM-1、MMP-9水平均异常升高，与上述研究结果一致。

本研究结果显示，病例组患者入院第1天血清TGF-β、VEGF水平高于对照组，提示成年缺血型与出血型MMD患者血清TGF-β、VEGF水平异常升高。TGF-β是一种多功能细胞调节因子，能够参与细胞增殖、分化、迁移、细胞基质蛋白合成、免疫应答、损伤修复及血管生成等多种细胞生理过程［20］。研究表明，TGF-β可刺激MMD患者颞浅动脉来源的平滑肌细胞的增殖，故认为其在MMD血管形成中扮演了重要角色［21］。VEGF是目前作用最强的促进血管增生的生长因子，其可影响内皮细胞增殖、迁移及血管渗透性，已被证实参与多种中枢神经系统疾病，如脑出血、脑梗死、MMD、颅内肿瘤等血管增生的病理过程［22-24］。本研究结果显示，出血型患者入院第1天、第7天、第14天血清TGF-β、VEGF水平高于缺血型患者，提示TGF-β、VEGF可能参与了成年MMD患者颅内出血过程，但此结论还需进一步证实。

此外，本研究进一步分析成年MMD患者不同Suzuki分级与入院第1天血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平的关系，结果显示，Suzuki分级3级缺血型患者血清MMP-9、VEGF水平高于Suzuki分级2级患者，Suzuki分级3级出血型患者血清VEGF水平高于Suzuki分级2级患者；Suzuki分级4级缺血型、出血型患者血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平分别高于Suzuki分级2、3级缺血型、出血型患者；Suzuki分级5、6级缺血型、出血型患者血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平分别高于Suzuki分级2、3、4级缺血型、出血型患者；Suzuki分级6级缺血型、出血型患者血清VEGF水平分别高于Suzuki分级5级缺血型、出血型患者，提示缺血型、出血型成年MMD患者血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平均随着Suzuki分级增高而升高，表明血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平与MMD患者病情严重程度有关，可作为临床诊断及评估的参考指标，与杨学丽等［25］部分观点一致，其与本研究不一致的部分为不同类型的MMD患者同一Suzuki分级的VEGF水平有统计学差异，其产生不同结果的原因可能是样本量、患者的个体差异及病例纳入与排除标准不同。

本研究Pearson相关分析结果显示，缺血型、出血型患者血清VCAM-1、MMP-9水平与血清TGF-β、VEGF水平呈正相关，提示无论何种类型的成年MMD患者的血管增生相关因子表达异常与血清VCAM-1、MMP-9水平有关，可能是血清VCAM-1、MMP-9水平与血管增生相关因子存在协同作用，共同影响MMD进程。陈祥［26］认为，血清VCAM-1、MMP-9水平可从血管渗透性、免疫炎症、细胞增殖和凋亡等方面影响MMD患者血清TGF-β、VEGF水平，但相关发生机制及血清VCAM-1、MMP-9水平是否影响其他血管增生相关因子水平仍待后续深入探究，且本研究样本量有限，研究结果可能还会受患者的具体用药及手术方式等干扰，相关结论还需进一步论证。

综上所述，缺血型和出血型成年MMD患者血清VCAM-1、MMP-9、TGF-β、VEGF水平均异常升高，且均与患者病情严重程度相关；缺血型、出血型MMD患者血清VCAM-1、MMP-9水平分别与血清TGF-β、VEGF水平呈正相关，VCAM-1、MMP-9可能参与了成人MMD患者颅内出血过程。

作者贡献：陈捷进行试验设计与实施、资料收集整理，撰写论文并对文章负责；程亚玲、陈海燕进行试验实施、评估、资料收集；官念进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。