塔克拉玛干沙尘暴源区空气可培养细菌多样性

夏库拉·巴克特亚尔，林 青，刘珍珠，杨红梅，娄 恺*

(1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.新疆农业科学院微生物应用研究所，新疆 乌鲁木齐 830091)

【研究意义】沙尘暴是干旱及半干旱地区频繁发生的一种典型的灾害性天气[1]。塔克拉玛干沙漠作为亚洲沙尘暴事件的主要来源之一，在发生沙尘暴期间，能携带沙尘向东吹至日本，穿过太平洋抵达美国，对全球生态系统和气候变化有重要影响[2]。沙尘粒子中携带大量的生物气溶胶，包括细菌、病毒、真菌及孢子，且生物气溶胶可以产生和传播过敏原与毒素，从而增加人们患心血管疾病、呼吸道疾病、癌症和其他疾病的风险[3-7]。生物气溶胶随着沙尘暴可以长距离运输并且可以在大气层中维持几个小时甚至几天，对下风向地区的生态系统、农业、交通、经济发展造成了严重的影响[8-10]。【前人研究进展】Attiya等利用卫星检测对伊拉克地区1980-2015年间的沙尘气溶胶指数进行了研究，发现沙尘气溶胶浓度对空气质量变化有重要的影响[11]。Griffin等[12]采用可培养方法对受非洲沙尘暴影响的加勒比海区域空气微生物进行了研究，发现在有沙尘天气和没有沙尘天气中可培养空气微生物的多样性发生了变化。Goudarzi等[13]对伊朗沙尘暴期间细菌特征和可吸入颗粒物进行了研究，指出可吸入颗粒物和空气细菌浓度之间有密切的联系。LI Jingxin等[14]对塔克拉玛干沙漠南缘的和田地区空气污染事件进行了研究，结果表明，在发生沙尘暴时可吸入颗粒PM10的含量明显上升。李鸿涛等[15]在沙尘天气对生物气溶胶中总微生物浓度及粒径分布的影响研究中指出，沙尘发生时，生物气溶胶中总微生物浓度显著增加，微生物的粒径分布发生明显变化。李婉欣等[16]对西安市秋冬季不同空气质量下可培养微生物气溶胶浓度和粒径分布发现，随着空气污染等级增加，细菌气溶胶粒径分布向粗颗粒迁移且环境因子对微生物气溶胶的影响不同。目前国内对空气微生物的研究多见于城市生态系统、垃圾场、医院、旅游景点等与人类生产活动相关的区域[17-20]，而对高温、干旱的极端环境空气微生物的研究鲜有报道。【本研究切入点】因此，本研究以塔克拉玛干沙尘暴源区(尉犁、若羌、且末、民丰、于田、策勒、G217国道、沙雅和库车地区)为研究对象，对上述9个地区的空气可培养细菌进行分离纯化，及16SrRNA基因序列分析。【拟解决的关键问题】探讨沙尘暴发生前期、中期、后期空气可培养细菌的群落组成情况，并结合环境因子信息，阐述环境因子对空气细菌多样性的影响，为开发极端微生物资源和沙尘暴灾害预警工作提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究区域简介 塔克拉玛干沙漠位于新疆塔里木盆地中心，是我国面积最大的沙漠，也是世界上第十大沙漠和世界第二大流动沙漠。整个沙漠东西约1130 km,南北宽约600 km，面积33.76 km2。塔克拉玛干沙漠地处亚欧大陆，气候干旱，且塔克拉玛干沙漠地表有极其丰富的流沙，在特定闭塞地理环境中，风沙灾害频繁，每年春夏两季，沙漠周围及腹地沙尘天气平均多达90 d,各种强度的沙尘暴发生期通常跨越整个春夏季节[22-23]。

1.1.2 培养基 R2A培养基[24]：酵母提取物0.5 g、蛋白胨0.5 g、酪蛋白氨基酸0.5 g、葡萄糖0.5 g、可溶性淀粉0.5 g、K2HPO40.3 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、丙酮酸钠0.3 g、琼脂15.0 g溶解于1 L的蒸馏水，pH调至7.2。

1.1.3 引物序列 细菌通用引物[25]27F (3′-GACTCGGTCCTAGTTTGAGA-5′)和1492R (3′-ACGCCGTAGTGGTAGGAATT-5′)由新疆昆泰瑞测序公司合成。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 本研究于2018年4月12日-21日在尉犁、若羌、且末、民丰、于田、策勒、G217国道、沙雅和库车9个地区中的12个位点开展采样工作(图1)，全程3964 km。距地面1.5 m，将R2A平板置于手持式空气采样器中，设置空气流量为50 L/min,采样时间为3 min，每个时期设置4个平行样，装入无菌采样袋中，置于装有冰袋的泡沫箱内带回实验室进行培养。

1.2.2 菌株的分离、纯化与保藏 根据菌落形态、大小、颜色等特征挑取单菌落在R2A固体培养基中分离纯化4次获得纯菌，纯化后的菌株接种于斜面，用15 %甘油保种液洗脱菌苔，-80 ℃保藏。

1.2.3 分子生物学鉴定与系统发育分析 采用DNA提取试剂盒，按说明书提取菌株基因组DNA，使用细菌通用引物27F和1492R对细菌16S RNA基因进行PCR扩增。PCR反应体系(50 μl)：TaqDNA Premix 25 μl，上下引物(10 μmol/L)各0.5 μl，基因组DNA 0.5 μl，ddH2O 24 μl。PCR反应条件:95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性40 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min ，32个循环；72 ℃总延伸10 min。用0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测，将合格的PCR产物送至新疆昆泰锐测序公司进行双向测序。利用Chromas软件分析测序所得的16S RNA基因序列，去除低质量的测序碱基后得到的序列有效长度约为1500 bp。将有效序列提交至EZbiocloud(https://www.ezbiocloud.net/)数据进行BLAST分析，以16SrRNA基因序列相似性大于等于97 %作为同种菌株的划分标准。下载与目的序列最相近的菌株16S rRNA基因序列，通过MEGA7.0软件中的Kimura2-parameter model 模型计算进化距离，采用领接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树，Bootstrap设为1000次。

图1 采样点地理分布

1.2.4 环境因子关联分析 典范对应分析是结合采样地环境因子信息，阐述环境因子对沙尘暴空气细菌群落多样性的影响。空气中细菌群落结构与各环境因子间关系利用CANOCO软件中的典型对应分析进行运算输出。

1.2.5 物种多样性分析 定义16S rRNA基因序列相似性大于等于97 %作为同一种的归类原则。对塔克拉玛干沙尘暴源区的空气细菌进行多样性分析，计算多样性指数，比较不同地区沙尘暴前、中、后期的物种多样性组成差异。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离纯化、保藏

从R2A培养基上根据菌落的大小、颜色等形态特征的不同，共分离出144株空气细菌，纯化后-80 ℃保藏。提取菌株基因组DNA，PCR扩增16S rRNA基因后进行电泳检测，均能得到长度为1500 bp的单一条带。获得的16S rRNA基因序列GenBank登录号为MK6226-MK789758。

2.2 可培养细菌的多样性统计

从塔克拉玛干沙尘暴源区空气中共分离出144株细菌，经16S rRNA基因测序及序列比对。结果显示，144株细菌隶属于4个门32个属76个种,分别为放线菌门(Actinobacteria，41.67 %)、变形菌门(Proteobacteria,10.42 %)、厚壁菌门(Firmicutes,46.53 %)、拟杆菌门(Bacteroidetes，1.4 %)。沙尘暴前期有12个属，其中优势属为芽孢杆菌属(Bacillus,11.11 %)、节杆菌属(Arthrobacter，4.9 %)；沙尘暴中期有18个属，其中优势属为芽孢杆菌属(Bacillus,18.75 %)、马西莉亚属(Massilia，2.1 %)；沙尘暴后期有19个属，其中优势属为芽孢杆菌属(Bacillus,9.7 %)、短杆菌属(Brevibacterium，2.8 %)；沙尘暴前期、中期、后期共有的优势属为芽孢杆菌属，占分离细菌总数的38.89 %。在若羌1号采样点、且末1号采样点、库车地区、沙雅地区采集到了沙尘暴前期样品。在若羌2号采样点、且末2号采样点、民丰地区于田地区采集沙尘暴中期样品。在尉犁地区、策勒地区、G217国道、且末3号采样点采集沙尘暴后期样品。

在属水平上，细菌的多样性随沙尘暴不同时期变化明显。如图2所示，在沙尘暴前期，芽孢杆菌属(Bacillus)和节杆菌属(Arthrobacter)为优势属。其中，在若羌1号采样点优势属为芽球菌属；在且末2号采样点优势属为马西莉亚属(Massilia)；在沙雅地区优势属为芽孢杆菌属(Bacillus)和节杆菌属(Arthrobacter)，在库车地区优势属为芽孢杆菌(Bacillus)。

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不同颜色代表不同空气细菌，柱高代表该属所占比

图3 沙尘暴中期可培养空气细菌组成

如图3所示，在沙尘暴中期，芽孢杆菌属(Bacillus)和马西莉亚属(Massilia)为优势属。其中，在若羌2号采样点优势属为葡萄球菌属和芽球菌属(Blastococcus)；在且末2号采样点优势属为芽孢杆菌属(Bacillus)；在民丰地区优势属为芽孢杆菌属(Bacillus)和马西莉亚属(Massilia)；在于田地区优势属为芽孢杆菌属(Bacillus)。

如图4所示，在沙尘暴后期，芽孢杆菌属(Bacillus)和短杆菌属(Brevibacterium)为优势属。其中，且末3号采样点优势属为芽孢杆菌属(Bacillus)、考克氏菌属(Kocuria)等；策勒地区优势属为芽孢杆菌属(Bacillus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)；G217国道优势属为芽孢杆菌属；尉犁地区优势属为微杆菌属(Microbacterium)和短杆菌属(Brevibacterium)。由此可知，沙尘暴不同时期不同地点的空气细菌呈现多样性变化。

图4 沙尘暴后期可培养空气细菌组成

从每个种中选择1株代表菌种与同源性相近的典型菌株(表1)进行比较，2个种与已知菌的16S rRNA基因序列相似性达到100 %,72个种已知菌的16S rRNA基因序列相似性达到97.56 %～99.93 %,1个种与已知菌的16S rRNA基因序列相似性达93.97 %，可能为潜在的新种。

表1 塔克拉玛干沙尘暴源区代表菌株EZbiocloud比对结果

续表1 Continued table 1

续表1 Continued table 1

2.3 可培养细菌系统进化分析

选择有代表性的31株菌，利用MEGA7.0构建系统发育树(图5)。通过系统发育树，可以看出可培养菌株聚类于放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)。其中，放线菌门中分离获得21个属，60株；厚壁菌门中分离获得5个属，67株；变形菌门中获得5个属，15株；拟杆菌门中获得1个属，2株。S17与相似菌株独立聚为一类，且与已知菌的16S rRNA基因序列相似性为93.97 %，可能为潜在的新种，这有待于进一步确定。

2.4 环境因子关联分析

不同地区因地理环境因子而呈现出微生物的多样性和特殊性。结合采样点环境因子信息，分析环境因子对沙尘暴空气细菌群落多样性的影响(图6)。通过属和环境因子之间的CCA分析，不同环境因子对塔克拉玛干沙尘暴源区空气细菌多样性的影响大小为：温度>气压>海拔>风速>湿度。排序图中，前2个排序轴的特征值分别为0.523和0.347，环境因子轴与样点排序轴之间的相关系数分别为0.920和0.963。风速、湿度、海拔与沙尘暴空气细菌群落多样性呈正相关，气压和温度与沙尘暴空气细菌群落多样性呈负相关。

2.5 可培养细菌多样性指数分析

辛普森指数和香农指数用来估算样品中微生物多样性指数(表2)，其中Shannon值越大，说明群落多样性越高，而辛普森指数则相反。策勒地区后期沙尘暴空气可培养细菌的物种多样性和丰富度最高，若羌1号采样点沙尘暴空气可培养细菌的物种多样性和丰富度最低。整体上看，沙尘暴不同时期可培养空气细菌群落结构组成的多样性和丰富度大小水平为：后期>中期>前期。

图5 基于16S rRNA基因构建的空气细菌系统发育树

△代表沙尘暴前期；□代表沙尘暴中期；○沙尘暴代表后期

3 讨 论

本研究通过可培养方法对塔克拉玛干沙尘暴源区的12样点不同时期空气微生物进行研究，经16S rRNA基因序列与EZbiocloud数据库进行序列比对发现，可培养菌株属于厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌(Bacteroidetes)下32属的类群，其优势属为厚壁菌门中的芽孢杆菌属(38.89 %)，这与本实验室前人研究结果基本一致[26-28]。这是由于一些芽孢杆菌可以产生孢子来保护细菌，使它在强辐射、寡营养、极其干燥的环境中生存下来。沙尘暴中传输的微生物大多属于厚壁菌门、放线菌门、变形菌门、拟杆菌门类群，如芽孢杆菌属、微杆菌属、葡萄球菌属、诺卡氏菌属、红球菌属、节杆菌属、短杆菌属、库克氏菌属、副球菌属、马西莉亚属、土壤球菌属等，与本研究结果基本一致[29-34]。有报道指出库克氏菌可引起呼吸道感染、消化道感染、皮肤软组织感染、血流感染等人体所有组织系统感染，须引起临床医生和微生物检验人员的高度重视[35]。葡萄球菌菌属多数为条件致病菌，具有潜在的公共卫生隐患[36]。

本研究发现，S17号(93.97 %)菌株可能为潜在的新种。这一结果表明，沙尘暴这种极端的环境中，由于菌种的适应性机制而获得新种的可能性较大，因此在后续的实验中，对筛选菌种的培养基进行优化，为获得更多的新种奠定实验基础。极端环境大大提高了发现新种的可能性，很多研究指出极端环境是开发微生物资源的天然实验室。贺瑞含等[37]

表2 采样点不同时期空气细菌多样性指数

在北极苔原中可培养细菌的分离及其抗菌活性性测定中推测有22株细菌菌株为潜在新种；李晓亮等[38]在第六次北极科学考察海洋沉积物可培养细菌的多样性分析中发现6中潜在的新种；张万芹等[39]在贵州兴义喀斯特洞穴土可培养细菌多样性及其产蛋白酶、淀粉酶活性筛选发现至少有4种菌为潜在的新分类单元。王宁等[40]在比什凯克盐碱土壤可培养细菌的多样性报道部分菌株的16S rRNA基因序列同源性低于97 %，可能为潜在的新种。上述研究中获得新种都基于传统的分离纯化技术，从侧面反映可培养方法是微生物学研究中不可或缺的一部分。

环境因子对空气微生物的多样性、丰度、群落组成有重要的影响，这是由于不同环境中所生存的微生物不同。本研究结合环境因子(温度、湿度、海拔、风速、气压)阐述环境因子对沙尘暴源区不同时期空气微生物的影响。典范对应分析结果表明，不同环境因子对塔克拉玛干沙尘暴源区空气细菌多样性的影响大小为：温度>气压>海拔>风速>湿度。不同样点在沙尘暴的不同时期空气细菌群落多样性和物种组成存在差异，由此表明环境因子对空气细菌群落多样性和物种组成的影响不可忽视。段育龙等[41]在天梯山石窟壁画保存环境中空气细菌的季节性变化中指出相对湿度、温度及降雨等环境因子均对空气细菌群落产生影响。通过了解不同微生物所受的环境因子的不同，可以在后续研究中更好的把握微生物培养的条件。

塔克拉玛干沙尘暴源区存在丰富的空气微生物资源，但由于采样的特殊性和培养方法的局限性，本研究获得的菌株可能是沙尘暴空气微生物资源的冰山一角。因此在以后的研究中通过结合高通量测序、卫星数据轨道分析来获得更加准确、更加全面、更加深入的有关空气微生物数据[42-45]，为开发微生物资源、沙尘暴预警工作和荒漠化治理奠定理论基础。

4 结 论

(1)从塔克拉玛干沙尘暴源区空气中共分离出144株细菌，经16S rRNA基因测序及序列比对显示，144株细菌隶属于4个门32个属76个种,分别为放线菌门(Actinobacteria，41.67%)、变形菌门(Proteobacteria,10.42%)、厚壁菌门(Firmicutes,46.53%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，1.4%)。塔克拉玛干沙尘暴源区12个采样点可培养空气细菌在沙尘暴前期有12个属，中期有18个属，后期有19个属。

(2)通过属和环境因子之间的CCA分析，不同环境因子对塔克拉玛干沙尘暴源区空气细菌多样性的影响大小为温度>气压>海拔>风速>湿度。

(3)沙尘暴不同时期空气可培养细菌群落组成结构的多样性和丰富度大小水平为后期>中期>前期。