HPLC分析方法验证中有关问题再探讨

夏振华，刘文志，韩新荣，原潞潞

1 亚宝药业集团股份有限公司，运城 044602；2 广州科锐特生物科技有限公司，广州 510530；3 江苏艾苏莱生物科技有限公司，苏州 215123

药品测定的准确性通常是通过控制分析方法的误差来达到的，而分析方法是否准确必须经过分析方法的验证来考察。因此分析方法验证是保证药物分析结果准确性的前提和基础。对于制药企业而言，分析方法验证是保证药品质量可控的重要环节，同时也是企业技术水平的直接体现，无论企业的新药报批、还是国外注册和GMP检查，都有关于分析方法验证的明确要求。

《中国药典》2020版征求意见稿[1]、美国药典[2]及ICH[3]分析方法验证都制定有相应的指导原则，但均很宽泛，鲜有具体操作或说明规定的理由，以至于日常验证中对技术要求和法规要求产生理解上的偏差。如仅仅通过信噪比即确定方法的定量限，把线性的范围等同于定量的范围，没有关注样品的处理过程的验证；又如振摇溶出参数、样品溶液浓度、滤膜的相容性等验证内容以及系统适用性参数的制定不是根据验证的耐用性结果来制定的，有关物质的精密度测定的样品使用不含有待测有关物质等。总之，需要理解验证的真正目的和质量控制的基本原理，才能把握正确操作，使分析方法验证能真正起到保证药品质量控制的作用。

1 关于分析方法生命周期问题

近年来，ICH和《美国药典》纳入了[4]生命周期管理的理念，《美国药典》甚至直接将“分析方法的生命周期”作为一个新的通用章节（1220）予以收录。

分析方法的生命周期分三个阶段：①设计和开发阶段；②验证阶段；③持续监测阶段。分析方法的验证不是孤立的一项工作，它和分析方法的开发，甚至分析方法的设计分不开的，分析方法开发和验证是一个有机整体，即使分析方法验证完成后，仍需要在分析方法的生命周期中用于常规的放行或稳定性测试中持续监测分析方法的性能，以及测定结果是否满足质量控制要求，这是分析方法验证的最后一个阶段，直至分析方法的终止。分析方法验证和产品持续稳定性考察原理相同，重要性也是相当的；因此建议企业年度报告中增加一项分析方法的性能总结等内容，如分析一年共有多少OOS（超标）和OOT（超趋势）是由于分析方法本身的缺陷而引起的，并制订纠正预防措施，以便对所采用的分析方法进行持续改进。目前国内几乎没有企业进行这项工作，法规检查也忽略了这一重要内容。

2 关于分析方法的专属性

2.1 峰纯度问题

专属性是建立分析方法首先要考虑的问题，否则往往会导致测定的系统误差，而且在日常测定中很难发现，尤其当多个组分出峰完全重叠时，需要通过验证专属性的峰纯度加以考察。对于老产品的专属性的验证，使用过期样品进行峰纯度测定可能比强制降解样品更为科学，此外需要注意实际验证中经常出现峰纯度“假合格”和“假不合格”现象。“假合格”主要由于检测技术的限制使峰重叠等情况未能鉴别；但“假不合格”情况更多，主要是样品响应过高或过低、波长选择接近流动相中的有机相截止波长，缓冲盐的浓度过高或流动相附加剂的纯度等因素影响所致。

2.2 物料平衡问题

强制降解的物料平衡是广大分析工作者最为头痛的问题，分析方法验证的指导原则中没有关于降解条件的特别规定，因此做法各不相同。由于物料平衡主要是考察分析方法能否将所有杂质有效检出，所以含量测定没有必要进行物料平衡的考察，物料平衡的接受范围问题，至今没有统一的规定，其实以后也很难统一，需要具体情况具体分析。根据样品中各组分性质、降解率大小、强制降解杂质的结构、质量标准中杂质限度要求等因素作综合考虑，建议平衡率设置为95.0%～105.0%较为合适。有些企业将其制定为98.0%～102.0%，接受标准过于严格，只考虑HPLC方法本身误差，没有考虑未知杂质的结构、介质pH等因素的影响；也有些企业对于制剂考虑到辅料的影响，将平衡率制定为90.0%～110.0%，又过于宽松，失去物料平衡考察的意义。

2.3 分离度的计算问题

分离度是HPLC法测定中重要的系统适用性参数，也是专属性的重要考察参数之一，对于拖尾峰和峰形不好的峰，现代的色谱积分技术基本均能够很好解决分离度的计算问题，对于分离不好，尤其是色谱峰峰响应差别大的两组分不完全分离的情形，积分技术很难科学解决，改善分离成为唯一手段。《中国药典》2020版征求意见稿[5]和《美国药典》[6]均有二种方法即峰底宽法和半峰宽法，其实两者本质均一样；《欧洲药典》[7]有两种计算方法，即半峰宽法和峰谷比法（p/v法）。但对于两个组分响应相差很大或一个组分由于过载产生严重变形时，这些传统的分离度公式均不适用，会导致结果偏低或偏高，不能有效地反映真正的分离情况。此时如采用峰谷比法[7]或使用柱效、选择性和容量因子的公式进行计算[8]更为科学，可惜各国药典均没有收载这一科学的分离度计算方式。

2.4 空白辅料峰的问题

尽管待测溶液已过滤了空白辅料变得澄清，但测定溶液中空白辅料成分依然可达主成分浓度的几倍甚至几百倍以上，在进样后使流动相体系产生瞬间的波动，导致在死时间附近出现辅料峰，该峰往往是辅料的折、散射产生的峰，而不其吸收产生的，所以其响应并不遵循朗伯比尔定律，有时同样配方量的空白辅料和空白片产生的峰面积相差很大，不同品牌的辅料甚至同一品牌不同贮存条件、不同时间产生的峰也不一致，鉴于辅料峰的复杂性以及工艺的保密性，实际工作中如出现辅料产生的峰，一定要进行详细的调查，弄清是什么辅料、什么原因产生的，而不能简单地在检验规程中要求进样空白辅料溶液，这样既不科学也不现实。

3 关于分析方法验证的精密度

实际测定时虽然精密度好，但由于方法或测定仪器等系统误差因素，往往准确度未必好，但反之，精密度不好、准确度很难得到保证，因为测定的准确度是建立在良好的精密度基础上的，所以日常测定是通过测定平行样品，考察测定误差来达到控制准确度的目的。在日常验证过程中，精密度测定时常见以下一些问题：

3.1 有关物质和残留溶剂的精密度

在有关物质和残留溶剂的精密度测定时，当使用样品测定结果为未检出，由于分析方法是适用于符合质量标准或不符合质量标准的所有样品，所以应该在样品中加入适量的（如限度的50%～100%）待测杂质对照品，测定其含量的相对标准偏差（RSD）考察精密度是否符合测定要求，如不是同一贮备液进行稀释，由于贮备液取样量不同，需要通过计算回收率的RSD%来考察精密度是否符合测定要求。

对于有关物质的测定方法的精密度验证，除考察其含量的精密度外，还要考察忽略限以上杂质个数是否一致，这常被忽视。此外，质量标准中如规定最大未知单一杂质时，需标明最大单一杂质的保留时间或相对保留时间，防止不同样品测定时最大单一杂质的峰发生改变而失去统计意义。

3.2 含量均匀度

对于使用含量均匀度测定结果作为含量放行数据的分析方法，其精密度的验证就比较复杂，由于含量均匀度一般取10片/粒药物来测定结果的平均值，作为含量放行数据，同时计算A+2.2S值作为均匀度考察的指标，在该情况下，含量的精密度验证应该按照含量均匀度的10份而不是6份测定结果进行精密度考察，即每人测定10份，2人共20份，计算A+2.2S值作为考察指标，并与同批通过研磨或混合手段取得均匀样本测定的含量进行比较。

3.3 精密度的接受标准问题

《中国药典》2020版征求意见稿[1]对精密度的接受标准有详细规定，但这些指标值只考虑浓度对误差的影响，没有考虑方法操作（如预处理过程）、仪器本身等影响因素。药典也规定了适当放宽情况，所以可以根据实际情况制定接受标准，如对于含量RSD%接受标准一般为≤2.0%，但这个不是绝对的，对于原料药或范围要求很窄的制剂（制剂含量范围主要是考虑生产和工艺的波动范围，适当考虑分析测定的误差范围），应该制定更小的RSD%接受标准，如≤1.0%，以保证方法能够满足质量控制的要求。对于杂质测定方法验证的精密度接受标准列于表1供验证时参照使用，此表也适用于残留溶剂等微量成分的定量测定。

表1 杂质测定方法精密度接受标准推荐表

4 关于分析方法验证的检测限和定量限

任何测定方法包括测定仪器都有其灵敏度的限制，对于微量组分的测定，考察检测限和定量限非常必要，对于低于检测限的测定结果应为未检出（Not detected或ND表示），对于＞检测限、但低于定量限的测定结果，建议结果表达为低于定量限（below quantitation limit，BQL），只有高于定量限才可能准确报告检测数据，对于＜忽略限的测定结果通常使用低于忽略限（below disregard limit，BDL），但需要注明忽略限的具体规定如0.03%，此外忽略限不能＜定量限。关于检测限和定量限需要注意以下几个问题：

4.1 信噪比法的缺陷

ICH[3]信噪比法测定检测限和定量限，是将仪器的灵敏度测定方法用于分析方法，不太科学；因为待测组分和噪音的响应受仪器、柱效、试剂等影响，信噪比法测定的检测限和定量限不具有普遍意义上的代表性，只是一个偶然值，根据定量限原理，信噪比不＜10，必须所有测定结果（如通常6次）均不＜10，不能取平均值不＜10，也没有必要制订一个范围如8～12。此外，对所有定量限下测定峰面积的偏差需要制定一个接受标准，如RSD%≤10%，以弥补精密度测定没有考察定量限浓度下的精密度，同时定量限浓度需要符合线性和准确度要求，只有这几个条件全部具备才能确定为定量限，为此，通常先根据质量控制要求确定一个忽略限，然后直接进行信噪比测定，关注信噪比是否不＜10，不必考虑信噪比的具体数值是多少。由于信噪比法测定定量限值影响因素多，波动大，所以定量限除考察信噪比外，还应制订定量限不＞杂质限度的50%或更低的要求，以弥补这一不足，如果定量限接近限度值，建议使用限度法进行杂质控制，而不能使用定量法进行限度的质量控制。基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法，虽然和信噪比法原理相同，但比信噪比法结果重现性更好些，似乎有代替信噪比法的趋势。

4.2 关于噪音的测定

噪音的测定非常讲究，除应该选择平滑的地方外，还建议应该在离目标峰附近前后两段进行，取其最高者；因为只有目标峰附近的噪音才影响目标物的测定，远离目标峰噪音再大也不影响测定。测定噪音的时间30秒，如果成分多，以梯度洗脱方法15秒即可，因为15秒两组分已能很好地分离，目前所有组分用某一段相同的基线测噪音并不太科学（除非基线很一致），收集60秒以上更没必要，是自找麻烦的做法。

4.3 忽略限制定问题

忽略限和报告限数据值相同，但含义不同，前者为方法中的一部分，后者为制订杂质质量控制策略提供依据。制定忽略限需要根据方法和测定质量控制的要求，以及法规要求等因素综合考虑，由于仪器的噪音等因素，使用HPLC法测定杂质时，虽然《中国药典》没有提及忽略限，但在实际工作中制定了忽略限，将＜忽略限的峰不予计算，减少不少麻烦，ICH对报告限有具体规定，但只是基本要求，建议日常工作中制定更为严格要求容易获得专家的认可。通常将忽略限规定为0.03%，但不能一概而论，具体制定策略需要根据方法本身的噪音大小、杂质限度大小等因素来制定。原则上忽略限为杂质限度的1/5以下，如1/5计算值＞0.03%，取0.03%，如＜0.03%取1/5计算值，忽略限必须不能＜定量限，对于稳定性考察的测定由于需要进行趋势分析，建议直接将定量限作为报告限更有适用性。

5 关于分析方法验证的线性和范围

线性关系考察是定量分析的基础和必要条件，定量是基于呈一元一次方程的线性关系进行的，对于不呈线性的方法，可以通过转换，如HPLC-ELSD检测或使用二次拟合曲线法，如HPLC-CAD检测，但线性不是定量的充分条件，呈线性未必能够准确定量；这特别多见于低浓度受辅料干扰（线性一般只使用对照品进行）以及有背景吸收和扭曲效应等影响的情况，所以此时还需要考察方程的准确度和精密度，确定测定范围。此外，除了考察相关系数以确定是否呈线性外，还必须考察回归方程的截距问题，通常使用两种方法：一种为Y轴截距绝对值与标准（100%）之比法；另一种为剩余标准差标准（100%）之比法。两种方法均能反映截距的大小，对于含量应该不＞2%，对于有关物质和残留溶剂应该不＞25%（建议不＞15%更科学），如果截距不符合要求，不能说明方法不能定量，只是不能采用常用的一个对照浓度进行测定，需要每次测定时采用多个浓度的标准曲线法进行。

《中国药典》2020版征求意见稿[1]参照ICH要求报告残差平方和，这一指标是考察线性的各点偏离程度，是考察线性斜率、截距、线性的综合的标准，无法制定统一可建议的接受标准，法规上通常是要求报告残差平方和的数值，用于评定方法的优劣。

6 关于分析方法验证的准确度

虽然检测永远不能测定到待测成分的真实含量，但测定结果尽量接近真值是分析工作者的最高目标。虽然加样回收率对于某些样品由于崩解溶出等因素的影响不能完全反映准确度，但其仍然是验证方法准确度最好的方法，了解以下几个问题对于准确度的测定会有裨益。

6.1 《中国药典》2020版征求意见稿[1]关于回收率的接受标准为非对称范围，如98%～101%，因为不可能有化合物含量超过100%，超过100%部分完全是分析误差，所以原料药的标准范围呈非对称，如98.5%～101.0%，而加样回收率不同，真实含量为100%的上下波动，呈对称的正态误差分布，这一规定误导分析方法允许存在系统误差，即高于100%的误差小于低于100%的误差，药典表2中的回收率范围小数点位数不科学，98%～101%应为98.0%～101.0%，此外还有其他诸多问题，建议实际工作中不予采纳，对于杂质测定方法验证的回收率范围及误差接受标准，列于表2供验证时参照使用，此表适用于残留溶剂等微量成分的定量测定。

表2 杂质回收率范围及误差表

6.2 对于有关物质（包括溶剂残留）的定量测定，由于质量标准规定不是范围，仅是限度，所以应该分两部分进行，即在LOQ的浓度下和限度附近（限度的50%、100%和150%），其中限度浓度是决定产品合格不合格的关键浓度，是风险最大的区域，所以需要在该浓度的附近进行准确度的测定，不做50%的限度浓度是不科学，回收率范围一般规定为80.0%～120.0%，9次测定结果的RSD应≤10.0%，如果限度浓度高，可以严格到90.0%～110.0%，甚至95.0%～105.0%，而LOQ浓度比较低，加上远离限度值，风险较小，回收率范围可以适当放大到70%～130%，根据验证回收率来制订内控质量标准不失为一种科学的方法，如回收率为85.0%，考虑方法的准确度，限度可以从0.2%修订为0.17%。

6.3 对于有关物质测定，由于杂质对照品较难获得，常常使用与主成分相比进行测定，由于杂质和主成分的结构不同，响应可能不同，需要进行校正才能测定真实含量，否则为表观含量。《中国药典》2020版征求意见稿[5]和《欧洲药典》[7]使用的为校正因子，而《美国药典》[6]使用的是响应因子，两者互为倒数关系，对于质量型检测器由于响应与待测组分的质量关系，所以通常不需要测定校正因子。

校正因子最好为不同仪器和人员，至少测定两次，允许误差一般为10%，这是基于杂质回收率要求在90.0%～110.0%，这也就是国家食品药品监督管理局药品审评中心[9]规定0.9～1.1可不需要校正的原因，《英国药典》要求将0.8～1.2可不进行校正，此规定范围过于宽松，建议不予采用。此外，如药典方法进行验证或确认时，和药典规定值比较误差也应在10%内，由于影响校正因子准确的因素很多，如对照品含量误差（如吸水）、保留时间差别大、峰型差别大（如拖尾严重）、DAD和紫外检测器的差别、盐类药物对照品没有折算成活性部分等，鉴于药典校正因子的测定次数多，日常测定尽量使用药典的校正因子进行。

即使校正因子在0.9～1.0之间，建议按照实际测定校正因子的数值进行，可避免多次测定结果值在边缘上下的时候处理数据的麻烦，如校正因子发生改变，必须对以前测定的数据进行评估，特别是校正因子变大的情形。鉴于校正因子重要性，不管结果是否＜1.0，其结果建议均应保留小数点二位。

杂质的校正因子的测定有多种方法，但使用杂质线性的斜率和主成分的线性斜率比最为常见，杂质的线性最大浓度为限度的150%（或120%浓度），最低浓度为定量限（或忽略限浓度），但主成分的线性浓度要考虑不同限度要求的杂质以及低浓度的因素，最大浓度的确定比较复杂，建议使用最大的限度值的杂质的150%，或测定的对照低浓度的150%（两者取最大者）进行，以满足所有杂质测定的要求。

6.4 虽然讨论的主要针对HPLC法，对于顶空气相色谱准确度的验证，需要关注的是由于其测定原理是气液平衡，测定的是相对回收率，所以影响组分的气液平衡的因素在方法开发和方法验证中均要考虑，特别是对照溶液和样品溶液的溶质有很大差别，样品溶液中含有高浓度的样品，存在样品的基质效应，该效应有时是正效应，有时是负效应，正效应导致回收率偏高，负效应导致回收率偏低，具体与待测组分的结构、沸点、性质、稀释剂的种类有关，基质效应是顶空最大难题，在满足测定要求情况下减少样品量可以减少基质效应，但不能彻底消除，彻底消除基质效应的最好方法是采用标准加入法进行测定。

6.5 制剂和原料药的主成分含量的准确度测定浓度选择范围均在80%、100%、120%三个浓度下进行，但其目的并不相同，制剂的标示量通常在90.0%～110.0%，考虑到风险问题以及方法的适用性，所以在80.0%～120.0%浓度范围进行，而原料药是基于药典精密称量约的含义为±10%，即供试品浓度的90.0%～110.0%，同样考虑到风险问题以及方法适用性更广的原因，适当放宽为80.0%～120.0%浓度范围，对于中药，由于其主成分复杂，通常放宽到50%～150%的浓度范围。

《中国药典》2020版征求意见稿[1]规定如不能得到辅料全部成分，使用样品加入待测对照成分进行回收率考察，这样操作会导致实际待测成分均在测定浓度之上，没有包含低于测定浓度的准确度情况，而低于标准规定测定边缘数据得不到验证，存在极大风险。对于企业而言，在知晓处方和工艺情况下，最好进行模拟处方法进行回收率试验。

7 关于分析方法验证的耐用性

分析用仪器虽然经过校正，但允许存在一定的误差，如紫外检测器波长允许±1 nm，柱温允许±1 ℃～2 ℃等，分析方法没有规定一定要在验证方法仪器上测定，是所有经过校正合格的仪器上都能适用。此外，还有一个目的，是通过耐用性测定，在耐用性变动参数范围内改变均不算改变方法，比如流速，虽然仪器流速误差小，但仍然进行有±10%～20%的变动耐用性考察，主要是实际测定时为了保证符合系统适用性要求对某些参数进行调节。耐用性还要发现方法的风险点，为以后日常测定出现异常提供一些参考的信息。

7.1 耐用性除测定系统适用性参数外，还需测定目标物的含量并与正常测定条件作比较，在规定范围内，对于杂质测定方法还需要统计杂质个数和最大未知杂质的保留时间或相对保留时间，以考察不同条件下方法的检测能力是否耐用。

7.2 关于耐用性波长的考察，《中国药典》2020版征求意见稿[1]没有提及，主要是否进行波长微小变化的考察取决于测定方法，如HPLC法采用紫外检测器测定主成分时，往往利用同一结构的对照品进行比较，由于对照品和测定的主成分结构相同，其紫外吸收相同，所以耐用性就没有必要进行不同波长的耐用性考察，但如与主成分比较测定杂质，由于杂质和主成分结构不同，不同波长的校正因子不同，不同仪器波长存在一定的偏差如±2 nm，所以即使《中国药典》2020版征求意见稿[5]规定分析方法的波长不能改变，但耐用性验证需要考察不同波长情况下的测定结果，如波长参数耐用性不好，建议改为外标法，也可重新选择测定波长，使杂质和主成份在该波长附近紫外吸收曲线趋势尽量一致。

7.3 耐用性参数的变化在考虑仪器和计量误差范围外适当放宽即可，如果变化值放得过宽，会引起耐用性失败，如柱温，通常柱温箱的温度精度为±2 ℃，耐用性只需做到±3 ℃即可，同样，波长变化范围±2 nm（或±3 nm）。耐用性结果如发现分析条件对测定结果影响很大，必须在方法中予以说明，如缓冲液pH的变化范围±0.2，出现耐用性不好，可以严格到±0.1，但必须在分析方法中注明（不注明可视为±0.2）。

7.4 对照品溶液和样品溶液稳定性考察可以在耐用性中进行，因为对照品溶液需要作为控制对照在检测最后测定，以考察系统是否漂移。而样品溶液需要在稳定性情况下才具有代表性，测定时仪器不关闭才有验证意义，这和贮备液的稳定性考察不同，后者不是方法本身一部分，是为了节省对照品的用量而采取的管理上的措施，不需要在方法验证中同时进行，切不可混淆。

8 关于分析方法验证的系统适用性

系统适用性是保证测定结果准确的前提，分析方法验证不管进行什么项目的验证，均应作系统适用性的测定，以考察测定是否有效？如果测定方法中对照溶液参与测定计算还应进行检查对照的测定，以考察工作对照的容量操作是否有问题？如测定时间较长，还应该进行控制对照的测定，以考察整个测定过程中系统是否漂移？如果方法比较稳定，不必在测定过程中定期测定控制对照。此外，在验证总结中需将所有的系统适用性的数据予以列出，以利于评审专家的审评。

9 方法确认和方法转移

分析方法确认和分析方法转移是一个比较经济的验证分析方法，也是准确性的方式，《中国药典》2020版征求意见稿[10，11]专门增加了分析方法确认和分析方法转移两个指导原则，从法规上给予分析方法确认和分析方法转移的合法地位，是新版药典的亮点之一。虽然指导原则比较原则，但其意义很大，如制剂企业购买的原料药、辅料，其验证工作量巨大，如采用分析方法转移的方式可大大减轻企业负担，方法转移可以同一公司不同部门，也可以不同公司之间，但产品的生产工艺或处方必须完全一致，否则只能验证或确认。转移方式有4种[11]，即比对试验、共同验证、再验证、转移豁免，其中比对测试最为常用。

方法确认系药典方法，由于方法内容、样品情况不同，方法确认的项目指导原则[10]未作出具体规定，需要根据实际情况经过科学评估进行选择，由于原料药没有辅料的干扰和不存在崩解等因素，确认对于原料药较为适用，一般进行专属性、精密度和线性范围三个项目，分别考察干扰情况、测定误差和定量基础是否影响测定方法的准确度，如杂质的微量测定方法，还需要作定量限和检测限的测定，以考察方法灵敏度，对于制剂测定方法，由于辅料及工艺对测定方法准确度影响的复杂性，不建议进行确认，即使确认，除非有足够的科学评估，否则确认项目为除了耐用性外的其他所有验证项目。

10 其 他

10.1 对照品标化所采用分析方法应该经过验证，但验证需要标化后的对照品才能进行，这就存在“先有鸡还是先有蛋”的矛盾，如何解决这一问题，建议将对照品的标化和分析方法验证一起进行，两者同时进行以解决这一矛盾。

10.2 检测限和定量限、线性和范围、定量限浓度下的准确度三个项目一般直接使用对照品进行，也不需要加入样品，而其他项目则需要具体项目具体分析，如原料药不含辅料，在准确度的测定时，使用50%的测定浓度的样品溶液，分别加入30%、50%、70%的测定浓度的对照品来测定回收率。

10.3 通常分析方法与工艺及设备验证不同，不需要进行周期性再验证，即使仪器搬迁也不需要进行方法本身的再验证（仪器再确认是必须的），这是由于方法验证的目的和内容决定的，但如果生产工艺或处方的改变，质量标准限度或分析方法发生变化即使稀释剂的改变，都应该进行方法再验证，方法再验证不代表全验证，验证哪些项目依据具体情况进行评估后确定，可能评估结果是再验证，只需进行专属性验证，甚至可能不需要进行再验证。