百里香乙醇提取液对黄瓜枯萎病的抑菌作用

张 禄，康利平，刘佃林

（1.内蒙古广播电视大学，内蒙古 呼和浩特 010051；2.呼和浩特职业学院，内蒙古 呼和浩特 010051）

百里香（Thymus mongolicus Ronn），别名地椒，唇形科百里香属多年生草本植物，其精油具有抗氧化、抗微生物、杀菌消炎、治疗上呼吸道疾病等功效[1-2]。黄瓜枯萎病，又名萎蔫病、蔓割病、死秧病，是一种由土壤传染，从根或根茎部侵入，在维管束内寄生的系统性病害（导管型枯萎病），是黄瓜生产上较难防治的病害之一，常造成较大损失。枯萎病在黄瓜的整个生长期均能发生，以开花结瓜期发病最多。苗期发病时茎基部变褐缢缩、萎蔫猝倒。黄瓜枯萎病的病原菌为Fusarium oxysporum F.sp.cucumebrium Owen。目前，黄瓜枯萎病的防治主要采用化学农药防治，对土壤及黄瓜生产造成了农药残留的危害。为避免化学药品的危害，研究者们考虑用植物源抑菌剂代替化学药品进行蔬菜病虫害的防治。有研究表明，百里香精油具有抗微生物生长的特点[3-4]，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等的生长均有明显的抑制作用[5-7]。本试验利用百里香乙醇提取液对微生物生长具有影响的特点，研究其对黄瓜枯萎病病菌生长的影响，从而为黄瓜乃至蔬菜无公害栽培中病害防治提供新的思路和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

本试验所用百里香鲜样采自呼和浩特职业学院生物化学工程学院实训基地，干样为鲜样自然风干后所得；所用的黄瓜枯萎病病菌为Fusariun oxysporum F. sp. cucumebrium Owen。

1.2 方法

1.2.1 采样 待百里香植株生长到花期时，随机选择30 株植株采集百里香新鲜茎叶、鲜花，并分别存放。新鲜茎叶采回后，部分用于鲜样试验，部分去杂洗净自然风干后进行干样试验。为了方便试验数据统计，将茎叶鲜样编号为1，将茎叶干样编号为2，鲜花样编号为3。

1.2.2 萃取液制备 将采回的新鲜茎叶和鲜花剪碎，分别称取5 g，用滤纸包好置于萃取烧瓶内，烧瓶内放入70 mL 无水乙醇，自来水冷凝，萃取2 h，回收萃取液，标记为1、3，分别设3 次重复。百里香干样的处理同鲜样，获得干样萃取液，3 次重复，标记为2。

1.2.3 接菌与培养 提取液对黄瓜枯萎病病菌生长的影响参考贾俊英等[8]的方法，采用PDA 培养法进行。对上述1、2、3（茎叶鲜样、茎叶干样、鲜花样）3 种提取液分别稀释2 倍、5 倍、10 倍（记为1-2、1-5、1-10，2-2、2-5、2-10，3-2、3-5、3-10，共9 个处理）添加到20 mL PDA 培养基中，对照用无水乙醇代替提取液，分别稀释2 倍、5 倍、10 倍（记为CK-2、CK-5、CK-10）添加到20 mL PDA 培养基中，同时用PDA 培养基作为总对照，记为CK-0。

将上述9 个处理和3 个对照及1 个总对照各2 mL 分别添加到含有18 mL PDA 的9 cm×9 cm 培养皿中，做好标记，放平，待培养基凝固后进行接种，每个处理5 次重复。

接种时，采用0.6 cm 的打孔器进行。用打孔器从母板中将培养好的黄瓜枯萎病病菌打1 个菌落，置于培养皿中央，盖好皿盖，放到25 ℃培养箱中培养。

1.2.4 测量与数据分析 从培养48 h 开始，每隔24 h 采用十字交叉法测量菌落直径，直到枯萎病病菌长满培养皿为止。百里香乙醇提取液对黄瓜枯萎病病菌生长的影响可以通过抑菌率计算：

抑菌率/%=［（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径］×100

全部数据采用Excel 2007、SPSS 17.0 软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 百里香茎叶鲜样乙醇提取液对黄瓜枯萎病病菌生长的影响

由表1 可知，1-2、1-5、1-10 3 个处理中黄瓜枯萎病病菌随测量时间增加，菌落直径持续增加。到培养144 h 时，1-2 处理的菌落直径为4.506 cm，为CK-0 同时期的54.493%，是CK-2 的68.668%，说明1-2 处理对黄瓜枯萎病病菌生长具有一定的抑制作用。1-5 和1-10 处理病菌的生长速度非常相似，到培养144 h 时，其菌落直径均比CK-0 有少许降低，而与CK-5、CK-10 处理非常接近，说明这2 个浓度处理百里香茎叶鲜样乙醇提取液只具有微弱的抑制作用，且抑制作用主要来自萃取剂乙醇。1-2、1-5、1-10 3 个处理与总对照CK-0 的菌落直径均呈差异极显著（P<0.01），且与各自相同稀释倍数的对照CK-2、CK-5、CK-10 在各培养期内表现为差异极显著（P<0.01）。各处理的抑菌率与对照相比呈差异极显著（P<0.01）。由表2 可知，到培养144 h 时，1-2 处理的抑菌率达到45.507%，而CK-2 处理的抑菌率只有20.643%。

表1 百里香茎叶鲜样乙醇提取液不同稀释倍数处理黄瓜枯萎病病菌的菌落直径 单位：cm

表2 百里香茎叶鲜样乙醇提取液不同稀释倍数处理对黄瓜枯萎病病菌的抑菌率 单位：%

2.2 百里香茎叶干样乙醇提取液对黄瓜枯萎病病菌生长的影响

由表3 可知，2-2、2-5、2-10 处理对黄瓜枯萎病病菌生长的影响表现为随着测量时间的延长，菌落直径持续增加趋势。从稀释倍数来看，稀释2 倍时，2-2 处理百里香干样乙醇提取液的菌落生长速度最慢，菌落直径最小，到培养144 h 时仅为5.930 cm，稀释10 倍的次之，稀释5 倍时，菌落直径增长速率最快，与CK-0相比，2-2、2-5、2-10 处理的菌落直径均较小，分别为CK-0 的71.714%、85.198%、79.901%，表现为差异极显著（P<0.01）。说明百里香茎叶干样乙醇提取液对黄瓜枯萎病病菌具有明显的抑制作用，且以2-2 处理对黄瓜枯萎病病菌生长的抑制作用最强。由表4 可知，到培养144 h 时，2-2、2-5、2-10 处理对黄瓜枯萎病病菌的抑菌率分别为28.286%、14.802%、20.099%，且与CK-2、CK-5、CK-10 相比均差异极显著（P<0.01）。

表3 百里香茎叶干样乙醇提取液不同稀释倍数处理黄瓜枯萎病病菌的菌落直径 单位：cm

表4 百里香茎叶干样乙醇提取液不同稀释倍数处理对黄瓜枯萎病病菌的抑菌率 单位：%

2.3 百里香鲜花乙醇提取液对黄瓜枯萎病病菌生长的影响

由表5 可知，3-2、3-5、3-10 处理下，随着培养时间的延长，黄瓜枯萎病病菌菌落直径呈现先减小后增大的变化趋势。在48 h 时的菌落直径较大，而在72 h 时菌落直径减小，说明此期间百里香鲜花乙醇提取液对黄瓜枯萎病病菌的继续生长起到了抑制作用。伴随枯萎病病菌的继续生长，其菌落直径开始呈现持续增加趋势，到培养144 h 时，均达到了各处理的最大值。在各培养期内，除120 h 的3-5 与CK-5的差异不显著（P＞0.05）外，其他各处理与对照相比均差异极显著（P<0.01）。由表6 可知，与总对照CK-0相比，到培养144 h 时，3-2、3-5、3-10 处理对黄瓜枯萎病病菌的抑菌率分别为33.898%、15.093%、10.037%，且与CK-2、CK-5、CK-10 相比均差异极显著（P<0.01）。

表5 百里香鲜花乙醇提取液不同稀释倍数处理黄瓜枯萎病病菌的菌落直径 单位：cm

表6 百里香鲜花乙醇提取液不同稀释倍数处理对黄瓜枯萎病病菌的抑菌率 单位：%

2.4 百里香乙醇提取液稀释倍数对黄瓜枯萎病病菌生长的影响

由图1 可知，对百里香茎叶鲜样、茎叶干样、鲜花等部位的乙醇提取液分别稀释2 倍、5 倍、10 倍后，其抑菌率大小并不一样。其中抑菌率最大的是茎叶鲜样乙醇提取液，而这其中尤以稀释2 倍处理对黄瓜枯萎病病菌的抑菌率最大，可见百里香茎叶鲜样乙醇提取液浓度较大时对黄瓜枯萎病病菌的生长具有较好的抑制作用。

3 讨论与结论

植物精油具有一定的抑菌效果。吴慧清等[9]采用纸片法和试管法评估了42 种植物精油的抑菌效果，结果显示，植物精油对真菌和革兰氏阳性细菌的抑杀效果好，有11 种精油对5 种指示菌的抑杀效果较好，其中百里香排在第2 位。百里香精油具有多种生物活性，其中以抗菌活性最突出。SHIN 等[10]研究表明，百里香精油对致病菌肺炎链球菌、鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌等均具有抑制作用。樊明涛等[5]、裴海闰等[6]研究表明，百里香精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有抑制作用。百里香精油对真菌的活性也有抑制作用。UYTTENDAELE 等[11]研究发现，百里香提取物对蔬菜中的气单胞菌属细菌有调节控制作用。以上试验对于百里香提取物的研究主要集中在百里香精油，即以水作为溶剂蒸馏所得的精油成分，且其研究方向主要集中于动物或人类致病微生物的生长抑制作用上。而对于其他溶剂提取物以及在植物生产上的应用研究较少报道。本研究对百里香的茎叶、鲜花通过乙醇抽提方法得到提取液，并对其在黄瓜栽培中常出现的枯萎病病菌的生长情况进行了研究。结果表明，百里香茎叶鲜样、茎叶干样、鲜花对黄瓜枯萎病病菌的生长具有一定的抑制作用，且随着提取液浓度的增加，抑菌效果明显加强。在试验过程中同时研究了乙醇溶剂等倍稀释后对黄瓜枯萎病病菌生长的影响，结果表明，乙醇溶剂对病菌生长也具有抑制作用，乙醇浓度高的抑制效果强，这与提取液对病菌生长的影响规律一致。提取液中百里香提取物与溶剂对病菌生长的影响关系通过抑菌率的计算可以看到：在高浓度情况下，提取物对病菌生长具有抑制作用，而在低浓度下抑制作用减弱，甚至出现促进生长的表现。为更好地研究提取物对植物病菌生长的影响，选用对病菌生长影响较小的溶剂是很好的办法，有待今后进一步研究。同时，百里香乙醇提取液对黄瓜植株的生长是否具有影响也有待深入研究，这将对黄瓜无公害栽培及百里香提取液的开发具有重要意义。

本试验表明，百里香乙醇提取液对黄瓜枯萎病病菌生长具有抑制作用；百里香不同部位乙醇提取液对黄瓜枯萎病病菌生长的影响不同，以百里香茎叶鲜样乙醇提取液影响最大，百里香乙醇提取液浓度越大抑菌效果越强。