IL-4、VCAM-1、VEGF与VEGFR2在MDCK细胞中的表达分布

冶 金，杨 琨，阿依木古丽，乔自林，柏家林＊

（1．西北民族大学 生物医学研究中心 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；2．西北民族大学 生物医学研究中心 甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030；3．西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

犬肾传代细胞系（Madin Darby canine kidney，MDCK）由Madin和Darby于1958年从美国Cocker Spaniel母曲架犬肾脏组织中分离培育建立，是通常以贴壁方式培养的上皮样细胞[1,2]。MDCK细胞广泛应用于呼肠弧病毒、腺病毒和禽流感病毒等多种病毒的分离、纯化及扩增，对于不同流感病毒株的普遍敏感性使MDCK细胞被公认为是适于流感疫苗生产的重要细胞基质之一[3-5]。目前，国外已有多家公司生产的MDCK细胞基质流感疫苗获得美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）认证批准上市[2,6]，而国内的流感疫苗生产则还处于传统的鸡胚生产，主要是因为MDCK细胞成瘤安全性问题。白介素4（Interleukin 4，IL-4）、血管内皮细胞粘附因子（VCAM-1）、血管内皮生长因子（VEGF）、血管内皮生长因子受体（VEGFR2）是四种不同的细胞因子[7-11]，均与细胞成瘤过程相关。本文通过应用免疫组化SP法检测MDCK细胞中IL-4、VCAM-1、VEGF、VEGFR2四种细胞因子蛋白的表达及分布状况，为研究MDCK细胞内源性蛋白表达及功能作用提供数据支持，为探究四种细胞因子蛋白与MDCK细胞成瘤性之间的联系奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞：MDCK贴壁细胞（P-63），由甘肃省动物细胞创新中心提供。主要试剂：新生牛血清，购自兰州民海生物工程有限公司；DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶和PBS缓冲液，购自兰州百灵生物技术有限公司；组织细胞固定液（4%多聚甲醛），购自北京索莱宝科技有限公司；免疫组化染色试剂盒、Rabbit Anti-IL4l1 Polyclonal Antibody、Rabbit Anti-VCAM-1 Polyclonal Antibody、Rabbit Anti-VEGF Polyclonal Antibody、Rabbit Anti-VEGFR2 Polyclonal Antibody，购自北京博奥森生物技术有限公司；DAB显色试剂盒和苏木素染液，购自大连美仑生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞复苏及传代 从液氮中取出细胞冻存管，置于37℃水浴中快速晃动融解冻存管中细胞悬液，将细胞悬液接种至含有20 ml新鲜DMEM（含10% 新生牛血清）培养基的T-25细胞瓶中，吹打均匀后置于37℃，5% CO2培养箱中静置培养。为减小DMSO 对细胞的损伤，在细胞培养4～8 h内更换新鲜培养基。

1.2.2 细胞爬片制备 胰酶消化细胞后重悬细胞于完全培养基中，充分吹打使之成单细胞悬液，计数；将盖玻片置于6孔板中，按1×106/ml 的密度将单细胞悬液接种于6孔板中，置于37℃，5% CO2培养箱中培养过夜。

1.2.3 免疫组化SP法染色 取出细胞爬片，用PBS缓冲液轻洗细胞5 min；加入组织细胞固定液（4%多聚甲醛）室温固定细胞20 min；加入0.5% Triton X-100（PBS缓冲液配制）浸泡20 min；滴加3% H2O2室温孵育15 min以消除内源性过氧化物酶活性；滴加封闭用正常山羊血清工作液室温孵育15～20 min，倾去；滴加适当比例的一抗上，37℃ 孵育2 h或4℃过夜孵育；PBS缓冲液冲洗3遍；滴加生物素化二抗工作液，37℃或室温孵育15～20 min；PBS缓冲液冲洗3遍；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育15～20 min；PBS缓冲液冲洗3遍；DAB 显色，镜下观察适时终止（自来水冲终止）；自来水冲洗，苏木素复染室温30 s；自来水冲洗返蓝15 min；梯度酒精脱水；二甲苯透明后用中性树胶封片。

2 结果

在上述实验结果图中，MDCK细胞核着色为蓝色；IL-4（见图1）、VCAM-1（见图2）、VEGF（见图3）、VEGFR2（见图4）四种蛋白结合其对应的抗体着色为褐色，褐色深浅表现蛋白在细胞中的表达强弱，实验阴性对照（见图5）只对MDCK细胞的细胞核进行染色。IL-4在MDCK细胞中着色均一，在胞核及胞质中均有表达，呈弥漫性分布，定位于MDCK细胞胞浆中；VCAM-1、VEGF和VEGFR2则都呈片块性分布，在胞膜及胞质中表达，且VCAM-1、VEGF和VEGFR2均为胞膜强于胞质中表达，定位于MDCK细胞胞膜上。

图1 IL-4在MDCK细胞中的染色

图2 VCAM-1在MDCK细胞中的染色

图3 VEGF在MDCK细胞中的染色

图4 VEGFR2在MDCK细胞中的染色

图5 MDCK细胞阴性对照染色

（图1、图2、图3、图4分别为IL-4、VCAM-1、VEGF、VEGFR2蛋白在MDCK细胞中的染色结果；图5为阴性对照，只对MDCK细胞核进行染色，标尺均为20 μm）

3 讨论

IL-4是由Th2型细胞分泌的一种糖蛋白，是一种多效应细胞因子，同时研究发现IL-4参与细胞成瘤进程并抑制肿瘤免疫[12,13]；VCAM-1为血管内皮细胞粘附因子，分布于细胞表面或细胞外基质中，其表达强弱与肿瘤细胞迁移与扩散有关[14]；VEGF为血管内皮细胞生长因子、VEGFR2为血管内皮细胞生长因子受体，均与肿瘤细胞生长有关[15]。目前国外已有基于MDCK细胞生产的人用流感疫苗相继上市[16]，而国内目前还处于临床试验阶段，MDCK细胞作为疫苗生产用细胞系，其成瘤性密切关联疫苗质量安全问题。已验证IL-4、VCAM-1、VEGF、VEGFR2四种细胞因子蛋白在MDCK细胞中表达及分布，但是否影响MDCK细胞成瘤还需进一步研究。