改良六胺银染色法在真菌染色中的应用

2020-05-22吴佳君赵兰香余科科韩昱晨

临床与实验病理学杂志 2020年2期

邢杰，吴佳君，叶敏，秦钢，赵兰香，余科科，张杰，韩昱晨

近年来，随着广谱抗生素的滥用、免疫抑制剂和抗肿瘤药物的广泛使用，加之外科介入性治疗的不断发展与成熟，使得系统性真菌感染在原有的基础上日益增多。尤以肺部真菌感染位居首位，超半数的真菌感染会侵犯支气管、肺部，然而其症状和影像学表现均缺乏特异性，因此在病理上准确诊断出真菌感染显得极其重要[1-4]。随着诊断试剂盒不断的更新，虽然染色方法越来越简便，效果也越来越好，但同时也导致越来越多的技术员并不能很好的理解六胺银特殊染色方法的原理和过程。上海交通大学附属胸科医院病理科至今仍然使用手工配制试剂进行染色，并且不断改良配方，取得了很好的效果，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料随机选取2016年上海市胸科医院病理科存档的六胺银阳性病例20例，为保证实验结果评价的一致性，均选用手术切除标本。每例标本连续切片3张，分别用于原六胺银试剂染色、改良六胺银试剂染色、六胺银试剂盒染色。

1.2 试剂配制六胺银染色试剂盒购自Baso公司。六胺银染色试剂的配制[5]：(1)高碘酸溶液(原方法使用0.5%高碘酸溶液，改良法使用1%高碘酸溶液)；(2)六胺银储备液的配制，将3%六次甲基四胺水溶液100 mL加入到5 mL的5%硝酸银溶液中即形成白色沉淀，摇动可使沉淀立即溶解，澄清后放置于4 ℃冰箱中保存；(3)六胺银工作液的配制，将3 mL 5%的四硼酸钠加入到25 mL的蒸馏水中混合均匀，然后加入15 mL的六胺银储备液，搅拌混合均匀后即可使用；(4)1%氯化金水溶液；(5)2%硫代硫酸钠水溶液；(6)1%中性红染液(原方法使用1%中性红复染，改良法使用伊红复染)。

1.3 染色步骤将三种六胺银染色方法进行比较(表1)。

1.4 结果分析阅片方法：三种方法染色的切片分别由病理科两位主治医师和一位副高级医师进行判读和评分，并且所有切片隐藏病历号等常规使用的编号，因此参加判读的三位医生事先对切片的结果并不知晓。

1.5 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，使用χ2检验对三位医师的判读结果和评分进行统计学分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

改良六胺银试剂所染色的切片(图1)染色效果较好，与六胺银试剂盒染色结果(图2)差异无显著性(P=0.766)，原六胺银试剂所染色的切片(图3)，虽然能够区别阳性和阴性，但染色效果与六胺银试剂盒染色效果相比差异有显著性(P=0.005)，并且与改良六胺银染色效果相比差异有显著性(P=0.028，表2)。

①②③图1 改良六胺银试剂染色的效果图2 六胺银试剂盒染色的效果图3 原六胺银试剂染色的效果

3 讨论

真菌内的多糖化合物能够被酸氧化而暴露醛基，醛基能够将六胺银还原为黑色的金属银，从而在镜下观察到真菌。传统的六胺银染色方法中使用铬酸溶液作为氧化剂，由于铬酸氧化性较弱，后逐渐被高碘酸取代[6]。原六胺银试剂染色法使用0.5%高碘酸将多糖化合物氧化而暴露醛基，而改良六胺银试剂染色法使用1%高碘酸，且氧化时间也从原来的30 min增加到60 min，这种改良能够更好的将真菌的多糖化合物酸化从而暴露醛基。温度是六胺银染色的重要因素，温度必须不低于60 ℃，亦不能较高，时间不能过长，否则六胺银易氧化变浑浊出现黑色的氧化膜[7]，因此改良六胺银试剂染色法将温度从原来的58～60 ℃提高到65～70 ℃，时间仍然控制在60 min。最后使用伊红替代中性红复染，使得被染色成黑色的真菌在伊红的背景下更加清晰。