胃癌组织中CD26的表达与临床病理特征及预后的相关性

王文军，何 雷，李佳嘉，徐国祥，徐五琴，卢林明,2

胃癌发病率及病死率位居我国恶性肿瘤的第2位[1]，晚期胃癌生存率低，尚缺乏特异的肿瘤标志物及有效的预后指标。二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidase Ⅳ, DPPⅣ)于1966年由Hopsu-Havu和Glenner[2]首次在大鼠肝脏组织中发现的一个可降解含DPP肽链结构的水解酶；1991年发现其兼具T细胞活化功能，又称其为CD26[3]。DPPⅣ/CD26除了作为一种蛋白酶及免疫细胞调节因子外，其在肿瘤发生进展中既作为肿瘤抑制因子，又被认为是肿瘤促进因子，作用尚不一致[4]。目前，CD26在胃癌组织中表达的研究鲜有报道，本文采用免疫组化EliVision Super法检测CD26蛋白在人胃癌肿瘤细胞及肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)中的表达特征，并分析其表达与临床病理学特征及预后的相关性，以期为胃癌早期诊断、预后判断及临床治疗提供实验理论依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2016年1月～2017年7月皖南医学院弋矶山医院病理科存档的石蜡包埋组织。实验组均为手术切除的部分胃或全胃组织，合计90例(病理诊断均为胃腺癌)，其对应的90例癌旁正常胃黏膜组织(距离肿瘤边缘约5 cm)及18例胃上皮内瘤变组织(其中低级别上皮内瘤变12例，高级别上皮内瘤变6例，均为胃内镜黏膜下剥离术标本)作为对照组。胃上皮内瘤变患者18例，男性12例，女性6例；年龄43～79岁，平均61岁，中位年龄62岁。所有病例均由两位高年资病理医师根据WHO(2010)消化系统胃肿瘤分类标准进行病理诊断，患者术前均未行任何放疗及化疗。

1.2 试剂 浓缩型鼠抗人DPPⅣ/CD26单克隆抗体(OTI11D7)购自美国ORIGENE公司，EliVision Super免疫组化试剂盒(鼠/兔广谱型)、PBS缓冲液、pH 9.0 EDTA修复液和DAB显色液等均购自福州迈新公司。

1.3 TILs百分比判读标准 TILs主要有以下几种分布方式：肿瘤内部浸润的淋巴细胞散在分布于肿瘤细胞巢内，并与肿瘤细胞直接接触，没有明显的聚集趋势，即肿瘤内TIL(intratumoral TIL, iTu-TIL)；肿瘤浸润边界以内的间质中未与癌细胞直接接触的淋巴细胞，包括浸润边界区的淋巴细胞，即间质TIL(stromal TIL, sTIL)；还有一部分淋巴细胞远离浸润边界区，浸润的淋巴细胞较丰富并集中分布，通常呈淋巴样聚集，甚至在一些病例中可见淋巴滤泡样结构形成，即三级淋巴结构[5]。

参照2014年乳腺癌国际TILs工作组推荐的HE切片中重点关注sTIL的评价方法[6]，并综合2019年胃癌TILs评分系统[7]。本实验TILs百分比是指在HE染色高倍视野下，观察肿瘤中心区域内iTu-TIL和肿瘤浸润边界以内sTIL的TILs总和占总间质面积的百分比，取整个HE染色切片区域的平均值；排除肿瘤区域内人为挤压、坏死、玻璃样变以及先前胃镜活检部位的浸润性淋巴细胞；排除肿瘤边界之外、低级别/高级别上皮内瘤变及正常腺体周围的浸润性淋巴细胞；所有单个核细胞(包括淋巴细胞和浆细胞)均应评价，但白细胞(包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)除外。由两位病理医师采用双盲法分别观察切片评分后再取平均值。

1.4 免疫组化 上述存档蜡块组织均经10%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，4 μm厚切片。采用免疫组化EliVision Super法检测实验组和对照组腺上皮细胞及TILs中CD26的表达。所用抗体采用pH 9.0 EDTA修复液高压修复，DAB显色。以PBS代替一抗作为空白对照，以已知阳性病例作阳性对照。操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.5 判读标准 CD26表达定位于细胞质和细胞膜，染色呈淡黄色至棕褐色颗粒者为阳性细胞。CD26结果判定结合染色强度和阳性细胞数进行综合分级。(1)按染色强度评分：不着色为0分，淡黄色为1分，黄褐色为2分，棕褐色为3分。(2)阳性细胞百分率评分：阳性细胞数<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。将两项得分结果相乘：0～1分为阴性，≥2分为阳性；阳性率按阳性例数除以总例数计算。由两位病理医师采用双盲法分别观察切片，若观察结果相差3分则重新评定。

1.6 随访 患者随访结果来自出院患者的电话随访记录。本实验中观察的指标为总生存期，定义为从手术日到患者死亡时间，未死亡患者则记录最后一次随访时间。

1.7 统计学分析 应用IBM SPSS 21.0软件进行统计学处理，使用GraphPad 5.0软件作图。组间比较及相关性分析采用χ2检验。生存曲线分析采用Kaplan-Meier法，单因素生存曲线比较采用Log-rank检验，多因素分析采用Cox回归比例风险模型。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD26的表达及TILs百分比 CD26表达主要定位于细胞质，部分为细胞膜。胃癌肿瘤细胞的阳性率为67.8%(61/90)(图1A)，部分腺体腔缘呈线性着色，高级别上皮内瘤变组织阳性率为50%(3/6)，两者差异无统计学意义(χ2=0.800，P=0.397>0.05)；低级别上皮内瘤变(χ2=20.234，P<0.001)及癌旁正常胃黏膜组织均不表达CD26，与胃癌组织相比差异均有统计学意义(P<0.01)。高级别上皮内瘤变的CD26阳性率均高于低级别上皮内瘤变(χ2=7.200，P=0.025)及癌旁正常胃黏膜组织，差异均有统计学意义(P<0.05，表1)。

TILs百分比5%～50%，平均17.7%，中位数15%；以平均百分比为界值(cut-off)，将TILs分为<17.7%的低百分比51例(51/90，56.7%)和≥17.7%的高百分比39例(39/90，43.3%)。CD26在胃癌TILs(图1B)、低级别和高级别上皮内瘤变及癌旁正常胃黏膜间质淋巴细胞中均不表达。

AB

图1 CD26的表达：A.在胃癌肿瘤细胞中呈阳性；B.在胃癌肿瘤细胞中呈阳性，在TILs中呈阴性，EliVision Super法

表1 CD26在各组上皮成分中的表达

χ2值和P值表示胃低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变及胃腺癌分别与癌旁正常胃黏膜比较

2.2 胃癌肿瘤细胞CD26表达与临床病理特征及TILs百分比之间的相关性 胃癌肿瘤细胞CD26的表达与浸润深度和pTNM分期呈正相关，即浸润深度越深、pTNM分期越高，CD26阳性率越高(P<0.05)，而与其它临床病理特征及TILs百分比均无明显相关性(P>0.05，表2)。

表2 胃癌肿瘤细胞CD26表达与临床病理特征及TILs百分比之间的相关性

2.3 单因素生存分析 随访截至2019年5月31日，术后随访3～40个月，无失访病例，随访期间死于胃腺癌者24例，占26.7%(24/90)。CD26阳性者总生存率为67.2%(41/61)，阴性者总生存率为86.2%(25/29)，胃腺癌肿瘤细胞中CD26阳性者较阴性者总生存期短(χ2=4.900，P<0.05)(图2A)。肿瘤细胞CD26的表达、肿瘤大小(χ2=23.934，P<0.01)、浸润深度(χ2=12.936，P<0.01)、远处转移(χ2=103.421，P<0.01)和pTNM分期(χ2=38.081，P<0.01)(图2B)均为胃癌不良预后因素，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图2 胃癌肿瘤细胞CD26表达、pTNM分期与总生存期曲线：A.CD26蛋白阳性者较阴性者总生存期短(P<0.05)；B.pTNM分期Ⅲ+Ⅳ期者较Ⅰ+Ⅱ期者总生存期短(P<0.01)

2.4 多因素Cox回归模型分析结果 将胃癌肿瘤细胞中CD26的表达、肿瘤大小、浸润深度、远处转移和pTNM分期纳入Cox回归模型，分析结果显示：肿瘤大小、远处转移和pTNM分期均为影响胃癌预后的独立危险因素(P<0.05)，肿瘤细胞中CD26的表达、浸润深度并非独立危险因素(P>0.05，表3)。

表3 胃癌预后的Cox多因素回归分析

3 讨论

人DPPⅣ/CD26基因定位于2q24.3，编码一条包含766个氨基酸的多肽链，其相对分子质量为11.0×104，通常以同源二聚体的形式存在，是一种Ⅱ型跨膜蛋白，主要由三部分构成，包括胞膜内区、跨膜区、胞膜外区，属于丝氨酸蛋白酶家族成员，是一个广泛分布的丝氨酸蛋白酶。

CD26在不同肿瘤、同一肿瘤的不同研究中的表达模式及功能不同，而且在同一表达模式下其功能可能也不一致。如在结直肠癌[8]、胰腺导管癌[9]、子宫内膜癌[10]、尿路上皮癌[11]、恶性间皮瘤[12]等肿瘤组织中均较其相应正常组织表达高，在肿瘤细胞生长、增殖及侵袭中发挥促癌作用。而在恶性黑色素瘤[13]、非小细胞肺癌[14]中表达缺失或下调，抑制肿瘤细胞生长、迁移及成瘤。卵巢癌和胶质瘤中表达上调的CD26，在同一肿瘤不同研究中既显示促癌作用[15-16]，亦显示抑癌作用[17-18]。前列腺癌中CD26过表达[19]和下调[20]均与肿瘤进展有关。由此可见，CD26在各种肿瘤中的表达模式及功能作用表现的非常复杂。

目前CD26在胃癌中的文献报道尚少。据有限的报道显示，CD26在胃肠道如结肠正常腺上皮中不表达[8]，在结肠腺瘤和腺癌中均有表达，主要定位于细胞质，且呈现腔缘线性表达的特点[21]。Carl-McGrath等[22]的研究结果显示CD26在正常胃黏膜表面上皮和小凹上皮(4/10)偶有表达，定位于细胞膜和细胞质，胃黏膜固有层腺体不表达，肠化生上皮(3/3)和胃腺癌肿瘤细胞(7/10)中表达，但差异无统计学意义。

本实验结果显示，CD26在癌旁正常胃黏膜(0/90)及低级别上皮内瘤变(0/12)腺上皮内均不表达，在胃高级别上皮内瘤变(3/6)及胃腺癌(61/90)肿瘤细胞中表达上调，主要定位于细胞质，部分为细胞膜，也可见腔缘线性表达的特点。CD26蛋白在正常胃黏膜及低级别上皮内瘤变组织中不表达，在高级别上皮内瘤变的胃癌前病变到胃癌肿瘤细胞中表达逐渐增强，提示其在胃癌的发生进展中发挥重要作用，可作为胃癌早期诊断的候选标志物。但限于低级别和高级别上皮内瘤变病例较少，其结果和意义有待进一步扩大样本验证。

随着浸润深度和pTNM分期的提高，CD26阳性率呈正相关的升高趋势(P<0.05)，提示高表达CD26促进了肿瘤细胞的进一步侵袭和进展。其可能机制为：(1)CD26过表达后上皮相关的标志物E-cadherin表达下调，间质相关的标志物N-cadherin和vimentin等表达上调[8]，促进了上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。(2)CD26作为一种蛋白酶与腺苷脱氨酶(adenosine deaminase, ADA)、纤连蛋白、胶原蛋白等配体的结合，促进了肿瘤细胞外基质(extracellular matrix, ECM)中胶原蛋白的降解[23]，有利于肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移。(3)新鲜胃癌组织及4种胃癌细胞系异体移植瘤实验发现[24]，CD26+CD44+细胞较CD26+CD44-细胞和CD26-CD44-细胞增殖速度快、成瘤能力强，提示CD26和CD44是胃癌干细胞(cancer stem cell, CSC)标志物。(4)IL-17通过信号传导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)，将CD26-CXCR4-[CXC趋化因子受体4(C-X-C chemokine receptor 4, CXCR4)]静息状态的胃癌CSC激活为CD26+CXCR4+侵袭状态的胃癌CSC，诱导EMT，促使胃癌CSC更具迁移性、侵袭性和成瘤能力[25]。(5)CD26过表达激活了缺血诱导因子-1α(hypoxia inducible factors-1α, HIF-1α)与血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGFA)信号通络，通过促进肿瘤血管生成影响肿瘤生长[10]。

CD26除了在肿瘤细胞表达外，在肿瘤细胞周边的间质中也可见CD26阳性细胞，包括梭形的纤维母细胞、TILs[9,15]。Bailey等[26]研究认为，CD26highTILs富含趋化因子受体，具有更强的细胞毒性及抵制凋亡的能力，利于攻击肿瘤细胞，促使肿瘤细胞退缩；而Barreira da Silva等[27]的研究结果提示CD26+TILs抑制了CXCR3介导的抗肿瘤免疫，限制了TILs向肿瘤区域的浸润，与肿瘤免疫逃逸有关。本组实验中CD26在肿瘤间质细胞和TILs并未表达。因此，通过免疫组化染色评判CD26+TILs是否合理，TILs中CD26阴性是否与免疫组化试剂克隆号有关，CD26+TILs在肿瘤发生进展中到底扮演什么样的角色等疑问，仍需要作进一步的分析。

研究显示CD26除了可作为肿瘤诊断标志物外，也是一种非常有意义的预后评价指标。CD26在有些肿瘤中是一种正性预后因子[13,18]，有些则为负性预后因子[8,12]。胃癌CD26+CSC是一种潜在的负性预后因子，与其更具侵袭性的表型、强的成瘤能力和易发生药物耐受有关[24]。

本实验单因素生存分析显示，肿瘤细胞中CD26的表达、肿瘤大小、浸润深度、远处转移和pTNM分期均为影响胃癌预后的不良因素，与CD26作为一种负性预后因子研究结论类似。多因素Cox回归模型分析显示，肿瘤大小、远处转移和pTNM分期为影响胃癌预后的独立危险因素(P<0.05)，肿瘤细胞中CD26的表达、浸润深度并非独立危险因素(P>0.05)，可能与随访时间较短有关。

胃癌患者血清中可溶性CD26蛋白(soluble CD26, sCD26)的检测有利于术前早期诊断及术后局部复发或远处转移的判断[28]。随着CD26抑制剂在Ⅱ型糖尿病治疗中的广泛应用[29]，人源性CD26单抗YS110在恶性间皮瘤等恶性肿瘤Ⅰ期人体试验中抑制肿瘤细胞生长的作用也得到了证实[30]。

综上所述，CD26的表达在胃癌的发生、进展中扮演重要角色，其可作为胃癌侵袭能力、远处转移、临床病理分期、早期诊断及负性预后因子的重要参考指标。其在胃癌中的具体分子机制，sCD26血清检测、CD26抑制剂和抗体在胃癌治疗中的应用价值有待进一步研究证实。