三黄鸡卵黄性腹膜炎病原菌的分离鉴定与药敏试验

曹 刚 陈林文 张文波 李 欢 高 蕊 周亚南 戚 伟 朱芝秀

江西农业大学动物科学技术学院，南昌330045

卵黄性腹膜炎是产蛋鸡的一种常见疾病，其危害性呈现越来越严重的趋势[1-3]。因长期滥用同种抗生素，造成了细菌的普遍耐药性[4-5]，寻找高敏药物交叉使用迫在眉睫[6]。2019年12月中旬，九江某养鸡场8 000 只蛋鸡产蛋率下降20%。采集死亡鸡的肝脏和液化的卵黄，进行细菌分离鉴定及药敏试验，旨在找到高敏药物防治该病。

1 材料与方法

1.1 材 料

1）试验动物。病死鸡：江西九江某养鸡场；试验小白鼠：（20 g 左右）购自南昌大学动物试验中心。

2）药品及试剂。麦康凯培养基、ss 琼脂培养基、ss 琼脂斜面、伊红美蓝培养基：购自北京奥博星生物技术有限责任公司；革兰氏染色试剂、药敏试纸、微量发酵管：购自杭州天和微生物有限公司。

3）主要仪器。电热恒温培养箱：购自上海跃进科学仪器厂；光学显微镜：购自重庆光学仪器厂；电热压力蒸汽灭菌器：购自上海申安医疗器械厂；超净工作台：购自苏净集团安泰公司。

1.2 试验方法

1）病理解剖。将死亡鸡进行病理解剖，观察各器官的病理变化并取样。

2）病原菌的分离培养。将死亡鸡肝脏、卵黄无菌操作，分别接种于普通琼脂培养基、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、ss 琼脂培养基及ss 琼脂斜面，观察记录菌落形态变化，挑取单个菌落革兰氏染色镜检并进行纯培养。

3）分离菌的生化特性。将分离菌接种于葡萄糖、靛基质、硫化氢等微量生化反应管中，置灭菌平皿内37 ℃恒温培养24 h，观察记录细菌的生长特性及指示剂的变化，操作方法按照微量生化反应管说明书进行。

4）分离菌的药敏试验。按照纸片法[7]，用无菌棉签均匀涂抹分离菌于普通琼脂培养基，待培养基水分完全吸收后，按梅花状贴药敏试纸，37 ℃恒温培养24 h 后，测量其抑菌圈直径。

5）分离菌致病性试验。将性状一致的小鼠随机分为试验组和对照组（5 只/组），试验组分别腹腔注射分离菌培养液（0.5 mL/只），对照组腹腔注射0.85%生理盐水（0.5 mL/只），观察小白鼠的发病情况，将死亡小鼠剖检分菌，染色镜检。

2 结果与分析

2.1 解剖结果

肝脏点状出血；心冠脂肪出血；卵泡破裂和液化。

2.2 分离菌培养特性

得到L-d-1、L-d-2、L-d-3、L-s-1 和L-s-2共5 株分离菌。麦康凯培养基：L-d-1、L-d-2 和Ld-3 呈红色不透明（图1），L-s-1 和L-s-2 呈无色透明（图2）；伊红美蓝培养基：L-d-1、L-d-2 和L-d-3呈金属光泽（图3），L-s-1 和L-s-2 为无色透明（图4）；ss 培养基：L-d-1、L-d-2 和L-d-3 呈粉红色（图5），L-s-1 和L-s-2 呈黑色单个菌落（图6）；三糖铁琼脂斜面培养基：L-d-1、L-d-2 和L-d-3 斜面呈黄色（图7），L-s-1 和L-s-2 斜面变黄，穿刺处出现黑色沉淀，试管底部有气泡（图8）。5 株分离菌革兰氏染色镜检，均为G-短杆菌，两端钝圆，散在或成对出现（图9）。

2.3 分离菌生化特性

1）糖发酵试验：L-s-1 和L-s-2 不发酵乳糖及蔗糖，L-d-1、L-d-2 和L-d-3 发酵大部分糖类。

2）硫化氢试验：L-s-1 和L-s-2 产生黑色沉淀，L-d-1、L-d-2 和L-d-3 没有变化。

3）枸橼酸盐试验：L-s-1 和L-s-2 由绿变蓝色，L-d-1、L-d-2 和L-d-3 没有变化（表1）。

2.4 分离菌药敏试验

分离菌对青霉素类、四环素类等药物产生耐药，对氨基糖苷类、头孢菌素类等药物敏感（表2）。

2.5 分离菌致病性试验

死亡小鼠没有明显外伤，触摸无硬块。对其由腹部向颈部进行剖检，发现有腹水；对病死鼠取样分菌，分离到原病原菌（表3）。

3 讨 论

3.1 分离菌的种属

图1 红色不透明菌落

图2 麦康凯透明菌落

图3 金属光泽

图4 伊红美蓝透明菌落

图5 粉红色菌落

图6 黑色单个菌落

图7 黄色斜面

图8 产生黑色沉淀

图9 G-短杆菌

根据临床解剖特征、分离菌培养和生化特性，比对《伯杰氏细菌分离鉴定手册》[8]，得知L-s-1 和L-s-2 生化特性与沙门氏菌一致，确定为沙门氏菌；L-d-1、L-d-2、L-d-3 生化特性与大肠杆菌一致，确定为大肠杆菌；大肠杆菌与沙门氏菌混合感染引起卵黄性腹膜炎。

3.2 分离菌的生化特性

L-s-1、L-s-2 的生化特性与武志强[9]、黄世娟等[10]报道中的糖类、蛋白胨水、枸橼酸盐等生化试验结果均一致，而在硫化氢、尿素的结果上存在差异，可能是菌株不同造成；L-d-1、L-d-2、L-d-3 生化鉴定结果与李娟娟等[11]试验结果一致。

3.3 分离菌的耐药性

分离菌的耐药性与林安等[12]报道中的头孢唑啉、庆大霉素等的试验结果一致，与阿莫西林、氨苄西林、链霉素等的试验结果存在差异。这可能由于用药习惯、地域差异导致。

表1 病原菌生化特性

表2 药敏试验结果 mm

表3 致病性试验结果

试验结果表明，分离菌对多种药物产生耐药，因此必须在药敏试验后对症治疗，避免盲目治疗加重损失[13]。在实际治疗中，要选择合理的给药方式，轮换或交替使用不同的高敏药物[14]，而乳酸菌、枯草芽孢杆菌等益生菌作为抗生素的替代品越来越受到重视[15]，可辅助治疗，防止病原菌过快产生耐药性。

3.4 分离菌的致病性

动物试验结果说明，大肠杆菌致病性大于沙门氏菌，单一的沙门氏菌致病性弱，只有与大肠杆菌混合感染才引发卵黄性腹膜炎，导致产蛋率下降。

3.5 分离菌的防治

平时要加强饲养管理，做到舍内彻底消毒，改善饲养环境，定期用药物预防。饲料中添加适量维生素，提高鸡的抗病能力[16-17]，做到及时发现问题，寻找解决方案，避免进一步扩大损失。