奇台窖藏马铃薯病害病原鉴定

吕 卓，高勇刚，唐琦勇，楚 敏，顾美英，朱 静，程思琦，马晓雪，宋素琴，王 静

(1.新疆农业大学食品科学与药学学院,乌鲁木齐 830052;2.新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物重点实验室,乌鲁木齐 830091；3.五家渠新薯种业有限公司,新疆五家渠 831300)

0 引 言

【研究意义】新疆马铃薯主要种植在北疆地区，种植面积一般稳定在36.7 ×103hm2左右 (包括新疆兵团约6.1 ×103hm2[1]。奇台地处昌吉州东部，南依天山，属中温带大陆性半荒漠干旱性气候，是北疆马铃薯主要种植区之一。2018年奇台的马铃薯种植面积为0.13×104hm2[2]，占昌吉州马铃薯面积的20%，占新疆马铃薯面积的5%[3]。近年来，随着新疆马铃薯种植面积逐渐扩大，马铃薯病害的发生与危害日趋严重，降低了马铃薯的产量和品质。新疆马铃薯80%以农户窖藏为主，窖藏病害损失达20%～30%[3]。【前人研究进展】已报道新疆马铃薯窖藏病害有：干腐病 (Fusariumsp.)、黑痣病(Rhizoctoniasolani)、晚疫病(Phytophthorainfestans)、黄萎病(Verticilliumdahliae)、早疫病(Alternariasolani)和皮斑病(Polyscytalumpustulans)[4]。【本研究切入点】奇台是新疆马铃薯的主产区之一，也是马铃薯的种植老区，该区域马铃薯窖藏病害发生较为严重，在新疆具有代表性和典型性，研究引起新疆奇台窖藏马铃薯发生病害的病原菌种类。【拟解决的关键问题】采样马铃薯窖藏病薯，对病原菌进行分离鉴定和致病性测定，研究引起该地区马铃薯窖藏病害的病原菌种类，为新疆马铃薯的窖藏病害科学防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样品采集

2019年3月从新疆奇台农场3个大窖中采集病薯(大西洋品种)，随机取30个病薯块茎，观察外表并选择6个典型病症的薯块进行研究。

致病力测定：大西洋块茎购买于新疆乌鲁木齐市北园春农贸市场。

1.1.2 试剂与仪器

培养皿(90 mm)、试管(10 mm×100 mm)、小刀、酒精灯、灭菌竹签，均购自新疆鼎国昌盛有限公司。

HVE-50自动高压灭菌锅，日本HIRAYAMA公司；SW-CJ-1F超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；SPX-250BF生化培养箱，上海福玛实验设备有限公司；SC-316 4℃立式保藏柜，海尔HAIER公司；NEP025-1回收试剂盒，鼎国昌盛有限公司；DL9700 PCR仪，东林昌盛有限公司；CH20BIMF200光学显微镜，日本Olympus有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分离与纯化

将病薯块茎的病健交界处削出5 mm的皮和块茎组织，用75%的乙醇表面消毒3 min，再用无菌水冲洗3次，用灭菌干燥的滤纸吸去表面水分后放置于无菌的PDA平板上置30℃条件下培养3～4 d后，再用灭菌竹签挑取病组织周围长出的菌落，在PDA平板上划线纯化，于30℃下培养，重复上述操作直至获得纯菌落，再转接于PDA斜面30℃培养3～4 d，置4℃冷藏下保存备用[5]。

1.2.2 致病性测定

根据柯赫氏法则采用伤口接种测定致病性并进行致病力比较[4]。通过比较发病程度来确定各致病菌的致病强弱。

1.2.3 菌株的形态及结构观察

挑取已纯化好的病原菌单菌落，将其接至PDA培养基中心位置，封口，于30℃黑暗条件下倒置培养3～4 d，观察菌落的形态，显微观察菌丝及菌体形态[6,7]。

1.2.4 菌株的分子鉴定

细菌的分子鉴定通过测定16S rDNA序列，扩增引物为F16S-27(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和R16S-1492(CGGTTACCTTGTTACGACTTC)，PCR产物经纯化、回收后，送鼎国昌盛有限公司进行测序。将已测序的序列在NCBI上进行Blast比对，选取同源性较高和形态相近菌株序列。表1

真菌的分子鉴定通过测定ITS序列，引物为ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，PCR产物经纯化、回收后，送鼎国昌盛有限公司进行测序。将已测序的序列在UNITE、NCBI上进行Blast比对，选取同源性较高和形态相近菌株序列。表2

表1 细菌PCR反应体系Table 1 PCR reaction system of bacterial

表2 真菌PCR反应体系Table 2 PCR reaction system of fungi

注：a：可培养细菌电泳； b：可培养真菌电泳
Note:a：Cultivable bacterial electropherogram；b：Culturable fungus electrophoresis map

图1 分离菌株PCR扩增电泳
Fig.1 PCR amplified electrophoresis map of the isolations

2 结果与分析

2.1 窖藏病害病原鉴定及分子辅助鉴定

研究表明,从奇台窖藏感病马铃薯上分离到12株菌株，其中细菌5株，真菌7株，12株菌的PCR扩增电泳图，将测序序列在NCBI网站上进行Blast比对并用MEGA V7.0做系统发育树，这些菌株分别属于芽孢秆菌属(Bacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、单胞菌属(Stenotrophomonas)、镰孢(霉)属(Fusarium)、帚霉属(Pseudoscopulariopsis)、踝节菌属(Talaromyces)、赤霉菌属(Gibberella)、地霉属(Geotrichum)、曲霉属(Aspergillus)9个不同属。表3,表4,图1～3

表3 奇台窖藏病薯中可培养细菌的种类Table 3 Isolation of culturable bacteria from potato in Qitai cellar

表4 奇台窖藏病薯中可培养真菌的种类Table 4 Isolation of pathogenic fungi from potato diseases in Qitai cellar

注：“-”表示未发现病害症状
Note：“-”Indicates that no symptoms of the disease were found

图2 奇台窖藏病薯中可培养细菌的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of cultured bacteria isolated from diseased potato from the Qitai cellar

图3 奇台窖藏病薯中可培养真菌的系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of cultured fungi isolated from diseased potato from the Qitai cellar

2.2 致病性测定结果及病原菌培养形态

研究表明,20 d后的部分接菌薯块的表面已出现腐烂症状，有的接菌薯块腐烂症状存在于马铃薯内部。致病性尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、虱状赤霉(Gibberellapulicaris)、白地霉(Geotrichumcandidum)对马铃薯存在致病性。在接种相同时间比较发病程度，伤口接虱状赤霉(Gibberellapulicaris)的第4 d，薯块伤口处出现环形腐坏症状；伤口接致病性尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)的第20 d，马铃薯腐烂严重；伤口接白地霉(Geotrichumcandidum)的第20 d，薯块切开后发现轻微腐烂，故确定致病性强度排序为虱状赤霉(Gibberellapulicaris)>尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)>白地霉(Geotrichumcandidum)。图4 ～6

Note:a、e、l：CK；b、c：Gibberellapulicaris；d：Pseudoscopulariopsishibernica；f、g、h：Fusariumoxysporum；i：Geotrichumcandidum；j：Talaromycesassiutensis；k：Aspergillusversicolor

图4 真菌分离物的致病性测定
Fig.4 Pathogenicity test of fungal isolations

2.2.1 镰刀菌Fusarium

致病性尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)，病菌形态显示，菌落为粉色，形态呈镰刀状，且周围附着着分生孢子。通过菌饼将病原菌接种在马铃薯块茎上后发现：病斑部分按压稍软，且有明显的腐臭味；内部出现黄褐色、不定形病斑，且侵染面积较广，挤压有菌脓；再次挑取病菌与原接种菌比较，确定为相同菌株。图5

2.2.2 赤霉菌Gibberella

虱状赤霉(Gibberellapulicaris)菌落呈黄色粉状，显微形态下菌丝周围多附着镰刀状的孢子。在伤口接菌的第4 d，薯块伤口处出现环形腐坏症状；20 d后随着病斑逐渐扩大，表皮下陷并皱缩，把病薯切开后，内部有空洞呈坏死状变褐，伴有菌丝生长，到后期发病严重时，块茎整个皱缩腐烂，表皮上长出霉状物。再次挑取病菌与原接种菌比较，确定为相同菌株。图6

注：a：伤口接菌图；b：病菌菌落图；c：病菌形态图(显微镜40×)
Note:a：Wound colonization map；b：Pathogen colony diagram；c：Pathogen morphology map(microscope 40×)

图5 致病性尖孢镰刀菌
Fig.5Fusariumoxysporum

注：a：伤口接菌图；b：病菌菌落图；c：病菌显微形态图(显微镜100×)
Note:a：Wound colonization map；b：Pathogen colony diagram；c：Pathogen morphology map(microscope 100×)

图6 虱状赤霉
Fig.6Gibberellapulicaris

2.2.3 白地霉菌Geotrichum

白地霉(Geotrichumcandidum)病菌形态显示，菌落扁平呈圆形，乳白色，表面短绒状且近于粉状，背面基质无色，呈放射线状生长，边缘色浅，清晰。菌丝呈二叉分枝，有横隔，无色。块茎发病症状：外观病斑呈圆形趋势，病斑下薯肉组织呈不定形向下扩展且易剥离，内部果肉缩小发灰，后期出现大量白色霉层；再次挑取病菌与接种菌比较，确定为相同菌株。图7

注：a：伤口接菌图；b：病菌菌落图；c：病菌形态图(显微镜40×)
Note:a：Wound colonization map；b：Pathogen colony diagram；c：Pathogen morphology map(microscope 40×)

图7 白地霉
Fig.7Geotrichumcandidum

3 讨 论

马铃薯干腐病是镰刀菌根腐类病害中最重要的一种病害，其窖藏期发病率最高可达60%，马铃薯干腐病的病原菌多为接骨木镰刀菌(Fusariumsambucinum)、锐顶镰刀菌(Fusariumacuminatum)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和芳香镰刀菌(Fusariumredolens)等[8]；据Rakhimov等[9]报道，枯萎病由镰刀菌的5个不同种引起的，即腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)、雪腐镰刀菌(Fusariumnivale)、接骨木镰刀菌(Fusariumsambucinum)。杨波等[10]明确了引起青海省马铃薯根腐类病害镰刀菌次为三线镰刀菌(Fusariumtricinctum)、燕麦镰刀菌(F.avenaceum)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、茄病镰刀菌(F.solani)、锐顶镰刀菌(F.acuminatum)和木贼镰刀菌(F.equiseti)。陈祥泰[11]明确了甘肃省窖藏真菌病害主要有12种病菌引起的6种病害，分别是干腐病、黑痣病、炭疽病、坏疽病、束梗褐腐病和晚疫病，干腐病病原共分离到7种；岷县马铃薯窖藏干腐病茄腐镰孢和木贼镰孢菌为主要病原。虱状赤霉(Gibberellapulicaris)是镰刀菌(Fusariumsambucinum)的有性阶段，是北美和欧洲马铃薯块茎干腐病的主要病原[12]。在新疆奇台窖藏马铃薯病薯中分离出致病性尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和虱状赤霉(Gibberellapulicaris)真菌病原菌，分离到的细菌都不是马铃薯细菌病害的致病菌。

白地霉(Geotrichumcandidum)可引起巴西红果[6]、甘薯[13]、番茄等多种植物的酸腐病。研究首先在新疆尼勒克生长期马铃薯分离得到，之后又在新疆奇台窖藏感病马铃薯块茎中分离出该菌。

4 结 论

从奇台窖藏马铃薯中分离得到12株菌株。其中，细菌5株，分别属于芽孢秆菌属(Bacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、单胞菌属(Stenotrophomonas)，都不是马铃薯细菌病害的致病菌；其余7株为真菌，分别属于镰孢(霉)属(Fusarium)、帚霉属(Pseudoscopulariopsis)、踝节菌属(Talaromyces)、赤霉菌属(Gibberella)、地霉属(Geotrichum)、曲霉属(Aspergillus)等。致病性测定结果表明病原菌有致病性尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、虱状赤霉(Gibberellapulicaris)、白地霉(Geotrichumcandidum)。其中白地霉(Geotrichumcandidum)在马铃薯上引起病害为国内首次报道。