大鼠皮肤挫伤后Beclin1、LC3的表达及其与损伤时间的关系

颜峰平，叶 星，陈圆圆

(赣南医学院法医学系，江西 赣州 341000)

法医学损伤时间是指人体组织、器官损伤后至检验时所经历的时间间隔，损伤时间推断是法医病理学研究和实践的重点与难点内容。客观、准确的损伤时间推断能为划分嫌疑人范围、推测嫌疑人的作案意图、现场重建等提供重要依据，具有重要的法医学意义[1]。现有研究认为通过检测损伤修复过程中各种生物学指标的变化趋势，并结合损伤的形态学变化，可以为损伤时间推断提供良好依据[2]。

细胞自噬参与皮肤损伤的修复过程已被研究证实。本研究通过建立大鼠皮肤挫伤模型，研究不同损伤时间段后自噬相关分子Beclin1、LC3的mRNA及蛋白表达情况，并探讨Beclin1、LC3在法医学损伤时间推断中的价值。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠42只，体重180～200 g，购自上海杰思捷实验动物有限公司。

1.1.2主要试剂及仪器5%水合氯醛(Sigma)，TRIzol试剂(Invitrogen)，RIPA裂解液(碧云天生物技术公司)，LC3抗体(CST)，Beclin1抗体(CST)，β-actin抗体(CST)，HRP标记的二抗(CST)，SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen)，PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)，荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)，蛋白免疫印迹化学发光仪(天能)，核酸电泳仪(天能)等。

1.2实验方法

1.2.1动物分组和模型建立SD大鼠随机分为正常对照组，皮肤挫伤后3 h、6 h、12 h、24 h、72 h组及死后皮肤挫伤组，每组6只，参考刘宁国等报道的方法构建大鼠皮肤挫伤模型[3]。在特定损伤时间后将大鼠颈椎脱臼处死，快速提取挫伤区皮肤组织置于-80℃冰箱冻存备用。正常对照组皮肤不作挫伤处理，取与挫伤组相同部位皮肤组织。

1.2.2总RNA提取和实时荧光定量PCR检测(RT-qPCR)挫伤组、对照组皮肤组织按TRIzol一步法提取总RNA，用紫外分光光度法检测所提取RNA的浓度和纯度，同时采用琼脂糖凝胶电泳判断提取的RNA质量。RNA在波长为260 nm和280 nm处的吸光度比值要求在1.8～2.2范围内，方可进行后续实验。

按照SYBR Green PCR试剂盒说明书配置RT-qPCR体系，然后在7500型荧光定量PCR仪上进行检测。荧光定量PCR引物序列见表1，GAPDH作为内参基因，采用2-△△Ct计算基因相对表达量。

表1 荧光定量PCR引物序列

1.2.3蛋白质免疫印迹反应(Westernblot)各组取适量皮肤组织加入裂解液匀浆，离心取上清液，按1∶1加入2X的SDS上样缓冲液中，放入100 ℃的沸水中加热10 min使蛋白变性，SDS-PAGE电泳分离蛋白质，电泳结束后，在转膜缓冲液中进行转膜，取出PVDF膜置于5%的牛奶中封闭1 h，封闭结束后，用TBST洗膜3次，5 min/次，在膜上敷上相应的一抗，4 ℃过夜。次日，TBST洗膜3次，5 min/次，加入相应的二抗，室温孵育1 h。最后配置ECL显色液(A∶B=1∶1)，在化学发光仪上对孵有相应抗体的条带显色。

2 结 果

2.1挫伤后各组皮肤组织中Beclin1、LC3的mRNA表达变化RT-qPCR检测发现Beclin1 和LC3的mRNA含量在挫伤后均呈现先下降后恢复至正常水平的趋势。Beclin1、LC3分别在挫伤6 h、12 h下降最为显著，在24 h、72 h均恢复至正常水平，死后损伤组与对照组比较差异无统计学意义(图1、表2)。

图1 挫伤皮肤组织中Beclin1和LC3 mRNA水平检测

表2 荧光定量PCR检测各组皮肤组织中LC3和Beclin1 mRNA相对表达量

注：a为与对照组相比。

2.2挫伤后各组皮肤组织中Beclin1、LC3的蛋白表达情况与对照组比较，挫伤后24 h内Beclin1、LC3蛋白表达下降，其中12 h组下降最为显著；72 h组升高至正常水平；死后挫伤组皮肤组织中Beclin1、LC3蛋白表达无明显改变(图2)。

图2 挫伤皮肤组织中Beclin1和LC3蛋白水平检测

3 讨 论

损伤时间推断是法医病理学领域一直未解决的问题之一。研究人员通过酶组织化学、免疫组织化学、分子生物学等方法检测机体损伤后各种炎症因子、化学因子、生活活性酶、生长因子等的表达并结合损伤的形态学变化，筛选呈规律性表达的标记物，可以为损伤时间推断提供良好依据[4]。但在法医学鉴定实践中，人体皮肤损伤的位置、范围多变且损伤程度不一，损伤后会受体内外多种因素的影响，很难寻找到有确切时间变化规律、并能应用于法医鉴定的某种或某类生物学标记物。因此寻找与损伤时间具有相关性的标记物仍是法医学研究的重点。

细胞自噬是真核生物普遍存在的自稳机制，细胞通过启动自噬清除胞内受损的蛋白质、细胞器或入侵的病原体等，利用溶酶体途径降解、回收利用降解产物以维持细胞稳定。细胞自噬与皮肤损伤愈合过程关系密切。目前有关自噬与皮肤损伤的报道尚少[5]。赖红梅等在小鼠切创的动物模型中发现Beclin1、LC3转录水平与蛋白表达水平具有相似规律：小鼠皮肤损伤后1 h升高不显著，6 h升高较显著，24 h到达高峰，48 h至72 h有所下降，切创皮肤组织中Beclin1、LC3的整体水平高于正常皮肤组织[6]。Asai等通过免疫荧光计数LC3阳性自噬点方法观察皮肤创面愈合过程中自噬发生的情况，发现伤后7～9天成纤维细胞存在高水平的自噬[7]。但Kimura等研究小鼠皮肤损伤后较短时间内(24 h内)自噬蛋白LC3和p62的表达情况，结果显示损伤0.5 h后LC3表达下降，p62相对量增加，说明皮肤损伤抑制了局部的细胞自噬[8]。皮肤损伤后细胞自噬的情况，上述各类实验结果表现出了差异，仍有待进一步研究。

本研究通过建立大鼠皮肤挫伤模型，采用RT-qPCR和Western blot方法从转录水平、蛋白水平研究自噬相关分子Beclin1、LC3的表达变化。结果显示Beclin1、LC3 的mRNA和蛋白表达呈现相似的变化规律，随挫伤时间延长呈先降低后升高并接近对照组水平的趋势，其中Beclin1、LC3的mRNA水平分别在挫伤6 h、12 h组下降显著，24 h、72 h组均升至正常水平；Beclin1、LC3蛋白含量挫伤后24 h内表达下降，在12 h降低显著，72 h恢复至正常水平；死后挫伤皮肤组织自噬相关分子表达无显著变化。说明皮肤损伤后较短时间内细胞自噬被抑制，与前述Kimura的实验结果一致，而随着伤后时间的延长，细胞自噬水平升高。我们认为细胞自噬参与了皮肤损伤后修复、愈合的过程，在损伤后的不同阶段发挥了不同作用。同时，Beclin1、LC3的表达与皮肤损伤时间具有一定的相关性，可以为皮肤损伤时间推断提供参考依据。但本研究仅采用动物模型进行观察，缺乏人体样本验证，实际检案中皮肤的损伤不同于实验动物模型， Beclin1、LC3作为损伤时间推断标记物在实践中的有效性仍有待验证。