油用牡丹凤丹种子休眠解除及组织培养研究

韦祖粉， 蒲振蕊， 鲁清清， 王 娟， 蓝增全， 吴 田

(1.国家林业草原局西南风景园林工程技术研究中心/西南林业大学园林园艺学院， 云南 昆明 650224；2.西南林业大学生命科学学院， 云南 昆明 650224；3.西南林业大学绿色发展研究院, 云南 昆明 650224)

油用牡丹(Paeoniaostii)属于芍药科芍药属牡丹组多年生落叶小灌木，生长于我国山东、河南、四川、陕西、云南等省。花属于中国传统名花之一，可以用于制作食品和饮料；根被称为“丹皮”，具有降低血压、抗菌消炎的功效。油用牡丹除了观赏、药用价值外还具有很高的油用价值，其籽油中不饱和脂肪酸含量达总量的90%以上，不饱和脂肪酸中α-亚麻酸含量达40%以上，被称为“世界上最好的油”[1]，已被国家农业部确认为一种新的食品[2-3]，作为一种新的木本油料作物资源[4-5]。

由于牡丹种子休眠的特性，种子萌发要求条件较高、繁殖周期较长、自然繁殖出苗率低等原因，且播种的时间也会影响其种子的出芽率[6]。传统的繁殖方式远远不能满足牡丹的大量生产，牡丹离体再生技术是目前最常用的技术，Demoise等[7]于1969年用牡丹种子的成熟胚为外植体成功诱导出愈伤组织。牡丹胚培养技术能够有效打破其种胚休眠，缩短萌发时间[8]。在牡丹种胚离体繁殖时必须打破休眠，获得生根苗，因为自然条件下其种子生根发芽困难，不能批量、高效的生产。所以，实现牡丹产业化发展，需解决种子休眠、生根难的问题。

本研究通过解除凤丹种子休眠，利用无菌胚苗为外植体进行丛生芽诱导及生根研究，提高凤丹的生根率及再生能力，建立凤丹种胚离体再生体系，为凤丹的快速繁殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1植物材料

牡丹凤丹种子收集于种植在山东省菏泽市牡丹种植基地的4年生牡丹植株。

1.1.2培养条件

WPM培养基pH为6.2，其余培养基pH均为5.8。除无糖培养基外，其余培养基中附加蔗糖30 g·L-1，琼脂7.6 g·L-1。在培养室(24±2)℃进行培养。

1.1.3数据统计分析方法

采用SPSS 17.0统计软件进行计算和单因素方差分析及独立样本t检验，显著水平p<0.05。

1.2 研究方法

1.2.1微波及赤霉素对凤丹种子解除休眠处理

凤丹种子解除休眠使用微波辐射和赤霉素(GA3)浸泡处理，解除凤丹种子休眠微波辐射时间和火力组合(表1)，共9个组合；赤霉素(GA3)浸泡时间和浓度组合(表2)，共13个组合。

表1 微波时间和火力处理组合

表2 赤霉素(GA3)浸泡时间和浓度组合

试验号赤霉素浓度/(mg·L-1)浸泡时间/h1002500123100012415001252000126500247100024815002492000241050048111000481215004813200048

1.2.2不同激素配比对处理种子萌发影响

经解除休眠处理的种子在无菌操作环境下进行消毒处理，先用75%乙醇浸泡消毒30 s，无菌水清洗2次，使用2%的次氯酸钠浸泡消毒4 min，无菌水清洗2次，再次重复使用2%的次氯酸钠浸泡消毒4 min，无菌水清洗5次，切取种胚接种到不同类型培养基及不同激素组合培养基中，观察其萌发情况，并分别统计萌发率[萌发率(%)=(种胚萌发数/不同处理的种胚数)×100%]。凤丹种子无菌萌发培养基为MS培养基、1/2 MS培养基、MS无糖培养基、WPM培养基、1/2 WPM培养基、WPM无糖培养基，不同培养基各接种40瓶，每瓶接种1棵种胚，不同培养基各重复3次试验；不同激素组合WPM培养基(表3)，共10种不同激素WPM培养基组合，以6-BA、GA3两种激素并添加不同浓度Ca(NO3)2进行凤丹种子萌发，不同激素组合培养基各接种40瓶，每瓶接种1棵种胚，每升WPM培养基中添加1 mg·L-1PVP，不同激素组合培养基各重复3次试验。

表3 不同激素组合WPM培养基

激素培养基编号不同激素质量浓度/(mg·L-1)6-BAGA3Ca(NO3)2/(mg·L-1)10.53121.05131.53242.05251.03361.05372.05181.53292.053103.051

1.2.3凤丹生根及快速繁殖

1) WPM培养基中不同激素组合诱导凤丹丛生芽。

以凤丹无菌苗为外植体，在WPM培养基中添加IBA、6-BA两种植物激素诱导丛生芽，培养基中附加2 mg·L-1PVP和250 mg·L-1Ac，不同激素浓度组合各接种20瓶，每瓶接种2棵无菌苗。每7 d观察1次生长情况，接种40 d后统计丛生芽的增殖系数，丛生芽增殖系数=(收获后丛生芽个数—接种丛生芽个数)/接种丛生芽个数。不同激素组合WPM培养基诱导凤丹丛生芽(表4)，共11种不同激素组合WPM培养基。

表4 不同激素组合WPM培养基诱导凤丹丛生芽

培养基编号植物激素浓度/(mg·L-1)IBA6-BA10.00.021.00.531.51.040.51.551.02.062.00.571.01.582.01.091.52.0100.52.5112.03.0

2) 不同基本培养基诱导凤丹丛生芽生根。

以凤丹丛生芽为外植体，接种至MS培养基、1/2 MS培养基、WPM培养基、1/2 WPM培养基中诱导生根，不同培养基各接种20瓶，每瓶接种1棵丛生芽。每10 d观察1次生长情况，接种35 d后统计生根数及生根率[生根率(%)=(生根的外植体数/接种的外植体数)×100%]。

3) WPM培养基中不同激素组合诱导凤丹丛生芽生根。

以凤丹丛生芽为外植体，接种至含有不同浓度IBA、NAA组合的WPM培养基中诱导生根。不同激素浓度组合各接种30瓶，每瓶接种1棵丛生芽。每10 d观察1次生长情况，接种35 d后统计生根数及生根率。WPM培养基中不同IBA、NAA浓度组合诱导凤丹丛生芽生根(表5)，共17种组合。

表5 WPM培养基中不同IBA、NAA浓度组合诱导凤丹丛生芽生根

培养基编号植物激素浓度/(mg·L-1)IBANAA100.0210.5320.5430.5540.5611.0721.0831.0941.01011.51121.51231.51341.51412.01522.01632.01742.0

2 结果与分析

2.1 微波辐射对凤丹种子解除休眠及萌发的影响

微波火力为10处理时间15 s、30 s与微波火力为20处理时间15 s萌发率最高，为33.85%；微波火力为30处理时间30 s和60 s的组合萌发率为0(表6)。因此，随着微波火力与处理时间不断增加，凤丹种子萌发率降低甚至不萌发，可能是微波火力太强且处理时间过长导致种子失去自由水水分，胚破坏，失去活力。

表6 微波处理解除休眠对凤丹种子萌发的影响

处理组萌发数/个萌发率/%10±0.58a0.83±1.44a212±1.53d30.83±3.82d313±1.53d33.35±3.85d47±1.53c18.33±3.82c512±1.53d30.83±3.82d66±0.58bc15.83±1.44bc74±0.58b10.83±1.44b84±1.53b10.83±3.82b90±0.00a0±0.00a100±0.00a0±0.00a

注：同列不同小写字母之间表示差异显著(p<0.05)，相同字母之间表示差异不显著(p>0.05)。下同。

2.2 赤霉素(GA3)浸泡处理对凤丹种子解除休眠及萌发的影响

1 000 mg·L-1赤霉素(GA3)浸泡24 h、1 500 mg·L-1GA3浸泡24 h、2 000 mg·L-1GA3浸泡24 h、1 000 mg·L-1GA3浸泡48 h、1 500 mg·L-1GA3浸泡48 h、2 000 mg·L-1GA3浸泡48 h的处理方式萌发率较好；GA3500 mg·L-1浸泡12 h萌发率最低，与其他处理组有显著差异(表7)。因此，综合处理浓度和时间的影响因素，解除凤丹种子休眠的最佳处理方式为1 000 mg·L-1GA3浸泡24 h。

表7 赤霉素(GA3)浸泡处理打破休眠对凤丹种子萌发的影响

处理组萌发数/个萌发率/%10±0.58a0.83±1.44a29±1.53b23.33±3.82b312±1.15c30.83±2.89c416±1.00d40.00±2.50d516±1.53d39.16±3.82d612±1.53bc29.16±3.82bc721±1.53e52.50±3.82e820±1.15e50.83±2.89e921±2.08e51.67±5.20e1016±1.73d40.00±4.33d1121±1.53e51.67±3.82e1221±1.53e53.33±3.82e1321±0.58e53.33±1.44e

2.3 不同类型培养基对凤丹无菌苗获得的影响

WPM培养基中凤丹无菌苗萌发率最高，为60.83%，MS无糖培养基萌发率最低，为19.17%(表8)。因此，使用WPM培养基为基本培养基更有利于促进凤丹种子萌发。

表8 不同基本培养基类型对凤丹种子萌发的影响

编号培养基类型萌发数/个萌发率/%1MS培养基 13±0.58c33.33±1.44c21/2MS培养基 11±1.53b26.67±3.82b3MS无糖培养基 8±1.53a19.17±3.82a4WPM培养基 24±2.08d60.83±5.20d51/2WPM培养基 16±1.15c39.17±2.89c6WPM无糖培养基10±1.53b25.83±3.82b

2.4 WPM激素培养基获取凤丹无菌苗的影响

9号培养基组合萌发率最高，为93.3%，1号培养基上萌发率最低，为43.33%(表9)。在6-BA、Ca(NO3)2浓度都相同的情况下，一定浓度的GA3有利于种子的萌发；低浓度的6-BA和过高浓度的6-BA都不利于种子萌发。因此，凤丹种子萌发最适激素培养基为WPM+1 mg·L-1PVP+5 mg·L-1GA3+ 1.5 mg·L-16-BA + 5 mg·L-1Ca(NO3)2。

表9 不同激素组合WPM培养基对凤丹种子萌发的影响

编号萌发数/个萌发率/%117±1.53a43.33±3.82a221±1.53bc53.33±3.82bc319±1.15ab46.67±2.89ab422±1.53c55.83±3.82c520±1.53abc50.83±3.82abc629±1.53e73.33±3.82e726±1.00d65.00±2.50d831±2.00e77.50±5.00e937±2.08f93.30±5.20f1032±2.52e79.17±6.29e

2.5 WPM培养基中不同激素浓度组合对凤丹丛生芽增殖的影响

9号培养基组合丛生芽增殖系数最高，为2.20；在对照组1号培养基中丛生芽增殖系数最低，为1，且芽纤弱；在7号和9号培养基上诱导出的丛生芽长势壮，在1、2、6、10、11号培养基上诱导出的丛生芽长势纤弱；在4、5、7、9、10号培养基上丛生芽增殖系数在1.5以上(表10)。因此，IBA、6-BA浓度过高会抑制凤丹丛生芽的诱导，凤丹丛生芽诱导增殖的最佳培养基为WPM+1.5 mg·L-1IBA+2 mg·L-16-BA+2 mg·L-1PVP+250 mg·L-1AC。

表10 不同激素组合WPM培养基对凤丹丛生芽增殖的影响

编号增殖芽数/个增殖系数芽生长情况140±0.00a1.00±0.00a纤弱245±2.00ab1.12±0.05ab纤弱349±2.00bc1.23±0.05bc一般463±3.00e1.57±0.07e一般576±5.00f1.91±0.11f一般656±3.00d1.42±0.08d纤弱764±3.00e1.61±0.06e壮852±4.00cd1.29±0.09cd一般988±4.00g2.20±0.09g壮1066±4.00e1.65±0.09e纤弱1148±4.00bc1.21±0.09bc纤弱

2.6 不同类型培养基对凤丹丛生芽生根的影响

WPM培养基丛生芽生根率最高，为21.67%；1/2 MS培养基、1/2 WPM培养基生根率无显著差异，MS培养基和WPM培养基生根率无显著差异，但使用WPM培养基进行诱导丛生芽生根时生根率高于MS培养基(表11)。因此，凤丹丛生芽诱导生根最适基本培养基为WPM培养基。

表11 不同基本培养基对凤丹丛生芽生根的影响

编号培养基类型生根数/个生根率/%1MS培养基 1±0.58a6.67±2.89b21/2MS培养基 0±0.58a1.67±2.89a3WPM培养基 4±1.15b21.67±5.77b41/2WPM培养基2±0.58a8.33±2.89a

2.7 WPM培养基中不同激素浓度组合对凤丹丛生芽生根的影响

11号培养基生根率最高，为55.56%，1、2、17号培养基生根率最低，7、11、13、14号培养基诱导出的根粗壮，但13、14号培养基中的植株长势较弱，7、10、11、12、15、16号培养基中的植株长势较壮，但10、16号培养基中植株的根长势较细(表12)。IBA浓度固定在同一浓度时，NAA浓度对于根的诱导无显著影响，但会影响植株的生长状态；NAA浓度固定在同一浓度时，IBA浓度对生根有影响，高浓度的IBA会抑制根的生成。因此凤丹丛生芽诱导生根的最佳培养基为WPM+2 mg·L-1IBA+1.5 mg·L-1NAA。

表12 不同激素浓度WPM培养基对凤丹丛生芽生根的影响

编号生根数/个生根率/%根状态植株生长状态10±0.00a0.00±0.00a-弱20±0.58a1.11±1.92a-弱33±2.08abc8.89±6.94abc细较弱44±2.65cd13.33±8.82cd较细较弱52±1.53abc7.78±5.09abc细弱66±2.52de21.11±8.39de较粗较弱79±2.00e30.00±6.67e粗较壮84±2.08bcd12.22±6.94bcd较粗较弱91±1.15ab2.22±3.85ab较细弱108±1.15e25.56±3.85e细较壮1117±2.52g55.56±8.39g粗较壮1213±1.73f43.33±5.78f较粗较壮131±1.53abc4.44±5.09abc粗较弱148±1.15e27.78±3.85e粗较弱157±1.53de22.22±5.09de较粗壮162±1.53abc5.56±5.09abc较细较壮170±0.58a1.11±1.92a-弱

3 讨 论

凤丹牡丹种子有休眠的特征，在自然状态下，种子发芽较为困难，周期较长，达半年之久，且出苗率较低[9-11]。鲍雪纤等在微波辐射处理滇青冈种子萌发实验中发现，微波辐射能够激活种子胚胎细胞的生长机制，提高了滇青冈种子的发芽率[12]；吴旭红等研究表明，有效的热击处理能提高大豆种子的发芽率[13]。GA3促进种子萌发，提高种子的发芽率，在多种作物上得到广泛应用[14-16]。在微波辐射解除凤丹种子休眠的实验中，未获得较高的萌发率，关于微波处理解除凤丹种子休眠还需进一步研究，优化改进时间和火力组合。GA3浸泡处理解除凤丹种子休眠的实验中，随着GA3浓度和浸泡时间的增加，凤丹种子萌发率不断上升。

在植物组织培养中植物激素是影响植株再生的主要因素，植物生长发育过程中，本身也会产生一定的内源激素，而内源激素对植物器官的发生有重要的作用，同时外源激素的调节也很重要[17]。外源生长素和细胞分裂素在植物器官的诱导和分化在植物生长发育中起到关键性作用[18]。本研究中，IBA、6-BA浓度过高会影响凤丹丛生芽的诱导，在凤丹丛生芽诱导增殖的培养基中附加 IBA 1.5 mg·L-1和 6-BA 2 mg·L-1诱导的丛生芽效果最佳。WPM培养基诱导生根率高于MS培养基，可能是因为WPM培养基适用于木本植物的原因[19]。在WPM培养基中附加2 mg·L-1IBA和1.5 mg·L-1NAA诱导凤丹丛生芽生根率为55.56%，根粗壮生长良好，随着IBA和NAA浓度的增加，诱导根的效果不佳且产生的不定根明显减少。研究表明，适当低温处理可提高离体培养外植体的生根率[20]。本实验对凤丹种子解除休眠、丛生芽诱导生根的研究没有达到较好的效果，可能是微波处理时间和火力组和不合理，以及不同激素浓度组合单一等原因，所以，找到更适合凤丹牡丹生根的方法，稳定又能得到大量生根苗对牡丹产业具有重要意义。