诸葛菜不同发育时期种子脂肪酸成分分析

薛应红，王志龙，郝月茹，邓咪咪，薛金爱

（山西农业大学分子农业与生物能源研究所，山西太谷030801）

诸葛菜（Orychophragmus violaceus），又名二月兰，属于十字花科诸葛菜属，是1 年生或2 年生草本，广泛分布于我国东北、华北、华东、西北等地区[1-2]。诸葛菜不仅具有较强的适应性，能在房前屋后、草地、林下、荒坡种植[3-4]，还具有生长周期短、生物量大[5-6]、农艺性状良好、抗逆性较强等特点，尤其是在华北地区寒冷的冬天仍然保持绿色不枯，因此，近年来逐渐受到许多育种专家的关注[7-9]。

诸葛菜因丰富的营养价值而成为一种多用途的作物[10]。有研究表明，诸葛菜由于其茎叶和籽粒中含有较多的蛋白质、维生素等多种营养物质，适口性较好[11-13]，可作为一种蔬菜或优质的牧草饲料[14]。诸葛菜由于其种子可以用来榨油，可作为油料作物，其育种主要集中于与油菜的杂交方面[15]，以油菜的雄性不育材料为母本，以诸葛菜为父本，进行属间远缘杂交育种（常规育种法），远缘杂交中可能存在不亲和现象，可采用蕾期授粉、胚挽救和子房培养[16]等方法，将诸葛菜的优良性状转移到油菜中,用以改良油菜的遗传背景。研究发现，诸葛菜是一种非常珍贵的油料作物[17]，由于其种子中积累了丰富的不饱和脂肪酸[18]，尤其是对人体有益的亚油酸（18∶2），长期食用可降低人体血脂和血清胆固醇，防止血栓形成以及动脉粥样硬化[19]，也可成为制作生物柴油和高级润滑油的工业原材料之一[20-21]。诸葛菜作为一种综合利用价值较高的新型油料作物，极具开发前景，然而目前有关诸葛菜种子中脂肪酸方面的研究和报道甚少。

本研究以诸葛菜为试验材料，采集不同发育阶段的果荚和种子进行形态学观察，然后先提取脂肪酸甲酯，通过气相色谱法分析种子中的脂肪酸组分，再提取总脂肪酸，以探究诸葛菜不同发育阶段种子中脂肪酸成分和含量的变化规律，以期为后续应用代谢工程技术改造脂肪酸来增加优良脂肪酸比例，将有益人体健康的脂肪酸用于制作保健品，而另外一些具有特殊功效的脂肪酸可作为工业原料制备工业用品，以提高诸葛菜的综合应用价值。

1 材料和方法

1.1 试验材料

诸葛菜种子采集于山西农业大学农作站试验田，选取长势良好且生长一致的诸葛菜，取其不同发育阶段粒大饱满的种子作为试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1 诸葛菜不同发育阶段的果荚和种子表型采集 采集早期（开花后11 d）、中期（开花后22 d）、晚期（开花后35 d）的诸葛菜种子和果荚，种子用体视显微镜（40×）观察后进行图像采集，果荚用尺子测量后进行拍照分析。

1.2.2 诸葛菜种子脂肪酸甲酯的制备 称取约10 mg诸葛菜种子，用液氮磨碎成粉末，加入1.5 mL 硫酸-甲醇溶液（2.5%，V/V）在试管中混合，并将试管放在恒温水浴锅上加热，80 ℃温浴90 min。将试管取出冷却至室温，将1 mL 0.9%的氯化钠溶液和1 mL己烷加入管中，振荡混匀，然后以4 000 r/min 离心15 min。抽取上清液转移到另一个试管中，通过鼓入氮气浓缩，在4 ℃下储存，沉淀用50 μL 乙酸乙酯溶解，分装到GC 瓶进行后续气相色谱分析。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 诸葛菜种子脂肪酸成分 分别将早期、中期、晚期的诸葛菜种子研磨成粉末，并称取10 mg样品置于干燥玻璃试管中。参照张玲慧[22]方法进行油脂和甲酯化的分析。甲酯化脂肪酸样品置于GC瓶中，-20 ℃保存用于气相检测。使用安捷伦7890B气相色谱仪检测TAG 中脂肪酸的成分和含量，色谱柱型号为HP-88，阶梯升温程序为：140 ℃保持5 min，然后以2 ℃/min 的速率上升至210 ℃，最后保持12.5 min；氢火焰离子化检测器（FID）的温度保持在250 ℃。

1.3.2 诸葛菜种子不同发育阶段的总脂肪酸含量的测定 分别选取早、中、晚期的诸葛菜种子用液氮磨成的粉末，设置3 个重复，加入石英砂使之充分研磨，先后分2 次加入7.5 mL 甲醇∶氯仿（体积比为2∶1），置于37 ℃的摇床抽提24 h，离心后收集上层有机相合并，加入5 mL 氯仿、9 mL 1%的NaCl 溶液，使得氯仿∶甲醇∶H2O 体积比为2∶2∶1.8，混匀后 以8 000 r/min 离心10 min，收集下层有机相，氮气吹干后计算脂肪酸的总质量。

1.4 数据处理

使用Excel 2010 和SPSS 23.0 软件对数据进行整理、绘制图表和差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 诸葛菜果荚和种子表型分析

从图1 可以看出，诸葛菜果荚呈长角果线形，具有四棱，喙长1.1 cm。诸葛菜种子卵形或椭圆形，长度约2 mm。具体来讲，早期果荚长7.4 cm，呈鲜绿色（图1-a），种子为透明状淡绿色（图1-d），经过体视显微镜近距离观察，发现种子为椭圆形，前端有凸出的喙，种子表面有纵条纹，条纹内有网格，网格向内凹陷，总体看来凹凸不平（图1-g）；发育中期的果荚长度增加到9.1 cm，除了喙部区域略带绿色，其余部位都已变成黄色（图1-b），种子颜色也相应变为棕黄色（图1-e），种子卵圆形，种子前端的喙变短，表面条纹间距变宽，凹陷变深（图1-h）；生长了35 d 的晚期果荚（图1-c）经过脱水萎缩，长度缩短为8.7 cm，总体显黄色，种子也将近干燥，颜色加深、为深褐色（图1-f），种子卵圆形，前端有短喙，种子脱水干燥后变紧实，为干瘪状，表面条纹间距更大，且凹凸状更加明显，沟壑也较深（图1-i）。

2.2 诸葛菜种子脂肪酸组分及含量分析

诸葛菜种子中的脂肪酸有棕榈酸（C16∶0）、硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1）、亚油酸（C18∶2）、亚麻酸（C18∶3）、二十烷酸甲酯（C20∶0）、花生烯酸（C20∶1）等。由图2 可知，早期的诸葛菜种子中油酸和亚油酸的含量分别为18.67%和49.47%，不饱和脂肪酸含量高达76.74%；中期的诸葛菜种子中油酸含量为19.22%，亚油酸含量为48.48%，不饱和脂肪酸含量为76.21%；晚期的诸葛菜种子中油酸和亚油酸含量分别为18.38%和48.27%，不饱和脂肪酸含量为75.97%。由此可以看出，早、中、晚期诸葛菜种子中的脂肪酸含量差别不大，不饱和脂肪酸含量远远大于饱和脂肪酸含量，不饱和脂肪酸中含量最多的是亚油酸，油酸含量次之，饱和脂肪酸中硬脂酸和棕榈酸含量最多。

诸葛菜是十字花科的一种，其种子中脂肪酸含量与其他十字花科植物的脂肪酸含量有一定差别，常见的十字花科植物有芥菜、芝麻菜、萝卜、拟南芥、亚麻荠等[24]。从图3 可以看出，芥菜中含量最多的脂肪酸是芥酸（C22∶1），占30.96%，其不饱和脂肪酸含量最高，可达92.54%，而其饱和脂肪酸棕榈油酸和硬脂酸含量最低，其他常见脂肪酸含量差别不大；芝麻菜脂肪酸含量最高的是也是芥酸，占43.50%，其不饱和脂肪酸含量仅次于芥菜；萝卜含量最高的脂肪酸是也是芥酸，占35.51%；拟南芥中含量最高的脂肪酸是亚油酸，占28.40%，芥酸含量（占1.88%）是最低的，其不饱和脂肪酸含量是6 种十字花科植物中最低的；亚麻荠含量最高的脂肪酸是亚麻酸，占31.86%，芥酸（3.03%）、硬脂酸和油酸含量相对较低[24]。

诸葛菜种子中的脂肪酸组成结构与上述芥菜等5 种十字花科植物的脂肪酸组成结构是一致的，都是饱和脂肪酸含量较低，不饱和脂肪酸含量较高，但是具体的脂肪酸含量有一定的区别。从棕榈酸的比例来看，诸葛菜种子中的棕榈酸要比其他5 种植物的棕榈酸都高得多；从硬脂酸所占比例来看，除了拟南芥与诸葛菜相近，其余4 种植物都比诸葛菜低；从油酸所占比例来看，只有萝卜和拟南芥与诸葛菜相差不多，其余3 种都比诸葛菜低；从亚油酸所占比例来看，诸葛菜要比其他5 种都高，其他5 种植物中芝麻菜比例最低，拟南芥比例最高；从亚麻酸所占比例来看，诸葛菜要比其他5 种植物都低，其中，亚麻荠的亚麻酸比例远高于诸葛菜种子中的亚麻酸；从花生烯酸的比例来看，诸葛菜要比其他5 种植物都低，其他5 种植物中拟南芥的比例最高；从芥酸的比例来看，芥菜、芝麻菜和萝卜中含量最高的就是芥酸，拟南芥和亚麻荠中芥酸含量很少，诸葛菜种子中几乎不含芥酸。

2.3 诸葛菜种子不同发育阶段的总脂肪酸含量分析

诸葛菜早期种子中每1g种子含总脂肪酸0.25 g，中期种子中每1 g 种子含总脂肪酸0.35 g，晚期种子中每1 g 种子含总脂肪酸0.40 g，由此可以看出，诸葛菜种子早期总脂肪酸含量最低，晚期总脂肪酸含量最高，总脂肪酸的含量随着种子发育时间的增加而显著升高，从早期到中期增加速度较快，后期增加趋势较为缓慢（图4）。单因素方差分析表明，诸葛菜种子早、中、晚3 个时期的总脂肪酸含量差异显著（P＜0.05）。

3 结论与讨论

诸葛菜是一种综合价值较高的新型油料作物，其早、中、晚3 个时期种子的脂肪酸组成和含量变化较小。脂肪酸组成主要包括饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸2 类，饱和脂肪酸主要有棕榈酸和硬脂酸，其中，棕榈酸的含量最高，占到饱和脂肪酸的58%左右；不饱和脂肪酸有油酸、亚油酸、亚麻酸，其中，亚油酸含量最高，占到不饱和脂肪酸的63%左右。诸葛菜种子的饱和脂肪酸含量比大部分十字花科植物要高。其种子的总脂肪酸含量随着时间的变化逐渐升高，呈增长趋势，并且早、中、晚3 个时期的总脂肪酸含量差异显著（P＜0.05）。研究诸葛菜不同发育阶段内种子中脂肪酸成分和含量的变化规律发现，诸葛菜是一个高亚油酸低芥酸的种质，可用于开发对人体健康有益的保健品等。本研究所得结果与孙小芹等[24]、马密霞等[25]的结果是一致的，饱和脂肪酸的含量低于不饱和脂肪酸的含量。诸葛菜种子油的经济价值取决于其脂肪酸的组成和含量，除了充分利用诸葛菜种子油的高亚油酸，还可以开发另一种脂肪酸——棕榈酸，诸葛菜种子油棕榈酸含量可达12%以上，这将为生产生物柴油开发原料来源。

诸葛菜作为一种新型油料作物，具有很大的开发潜力和广阔的应用前景。本研究通过对诸葛菜不同发育时期的种子进行脂肪酸成分含量的测定，为提高诸葛菜和其他油料作物经济、药用或工业价值奠定了一定的理论基础。