外源NO 对紫茎泽兰提取物胁迫下黄瓜种子萌发及幼苗根系抗氧化系统的影响

2020-05-19鲁一薇曹永恒孙娜娜马金虎杨小环

山西农业科学 2020年5期

鲁一薇，李颖，刘朦，曹永恒，孙娜娜，马金虎，杨小环

（1.山西农业大学农学院，山西太谷030801；2.山西农业大学工学院，山西太谷030801）

紫茎泽兰（Eupatorium adenophorum）是一种杂草，侵犯其他植物的能力十分强大。研究发现，紫茎泽兰的地上部分石油醚、乙醇和水提取物对多种粮食作物及蔬菜种子的萌发和幼苗生长发育均有抑制作用[1]。已有人根据这一特性拟将紫茎泽兰开发成植物源除草剂、杀虫剂、杀菌剂[2]，用来预防植物的病虫害。

一氧化氮（NO）是一种分子信号，在植物生长发育及其抵抗逆境方面起着重要作用[3]。低浓度NO对植物有一定的促进作用，但高浓度会抑制植物生长，甚至造成毒害[4]。李慧[5]研究表明，施用NO 后会使小麦叶片气孔关闭，减少小麦的水分蒸腾，从而提高抗旱能力。赵倩[6]研究表明，NO 可增强小麦种子和幼苗对提取物化感胁迫的耐性，减低幼苗根边缘细胞的死亡率。赵颖等[7]研究发现，低浓度外源NO 可提升渗透胁迫下紫花苜蓿种子的萌发。吴晓蕾等[8]研究发现，添加适宜浓度的硝普钠溶液显著促进了低氧胁迫下黄瓜幼苗的株高、干鲜质量、光合等指标，缓解效果明显。肖小君等[9]研究结果表明，在Pb 胁迫下，100 μmol/L 硝普钠溶液处理的效果最好，显著提高了保护酶的活性，增强了细胞的渗透调节能力，减缓了对水果黄瓜种子的伤害。外源NO 能提高干旱胁迫下高羊茅种子的发芽率[10]。薛盈文等[11]、路莹等[12]研究发现，NO 能促进盐胁迫下玉米幼苗及沙葱种子的根系（胚根）生长。目前关于外源NO 缓解紫茎泽兰提取物胁迫下黄瓜生长的研究鲜见报道。

本试验研究外源NO 对紫茎泽兰提取物伤害下黄瓜种子的萌发、幼苗根系结构的破损程度和根部抗氧化系统的影响，探讨NO 缓解紫茎泽兰提取物胁迫黄瓜种子萌发和幼苗生长的效应，旨在为NO 在植物栽培应用上提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试黄瓜品种为津优35 号，购于山东省聊城市瑞丰种业有限公司。

将采自云南普洱市的紫茎泽兰植株叶片，阴干粉碎后用95%乙醇，按料液比1∶4 浸提2 d，重复提取3 次，合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩，将浓缩液置低温真空干燥箱中干燥至恒质量。提取物用丙酮溶解成液体保存备用（1 g 提取物用5 mL 丙酮溶解，提取物溶液浓度为0.2 g/mL）。

NO 供体为硝普钠[Na2Fe（ON）5]（用SNP 表示），购自Sigma 公司。

1.2 试验方法

试验于2015 年3—7 月在山西农业大学农学院进行。设置去离子水（CK）、0.05 mmol/L SNP 的水溶液（NO）、1 g/L 紫茎泽兰提取物水溶液（ZL）和1 g/L 紫茎泽兰提取物＋0.05 mmol/L SNP 的混合溶液（ZN）4 种处理。采用纸卷发芽法[13]进行种子萌发试验，隔1 d 换一次处理液，直至对照不再萌发结束试验。种子萌发生长过程中，分别在4、6、8、10、12 d 取幼苗根系液氮保存用于后续各项生理指标的测定。同时，取萌发生长4 d 不同处理的幼苗根尖，制备电镜扫描的样品。不同处理设3 次重复。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 种子发芽指标的测定按种子检验规程[14]测定发芽率等各个指标和幼苗芽长、主根长和干鲜质量。

其中，Ga 为4 d 发芽种子数；Gn 为供试种子数；Ta 为8 d 发芽种子数；Gt 为发芽种子数；Dt 为发芽天数；W 为20 株生长12 d 的幼苗鲜质量。

1.3.2 电镜扫描样品的制作取不同处理的幼苗，切取幼苗胚根尖（约1 cm）迅速放到3%戊二醛固定液中，0～4 ℃下固定2 d。用磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH＝7.2）洗涤3 次，每次15 min，依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇系列脱水（每一梯度脱水15 min），最后100%的乙醇脱水2 次，每次20 min，后用叔丁醇置换，JEOL JFD-320 冷冻干燥，将干燥好的材料用导电胶带黏在样品台上，用JEOL JFC-1600 离子溅射镀膜仪喷镀铂金，喷镀好的材料放入JEOL JEM-6490 LV 扫描电子显微镜下观察拍照[15]。

1.3.3 生理指标的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定采用H2O2紫外吸收法；过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法；超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用氮蓝四唑法；可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝染色法；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸TBA 显色法测定[16]；抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定参照沈文飚等[17]的方法；超氧阴离子（）含量测定参照李忠光等[18]的方法；还原型抗坏血酸（AsA）测定参照邹琦[19]的方法。

1.4 数据统计及分析

试验数据均用SPSS 软件处理，采用Duncan 新复极差法检验数据显著性差异（α＝0.05）。测定结果为重复3 次的平均值。

2 结果与分析

2.1 NO 对紫茎泽兰提取物胁迫下黄瓜种子萌发和幼苗生长的影响

由图1、2 可知，紫茎泽兰提取物（ZL）处理中，幼苗侧根减少，与对照（CK）相比，种子发芽指数、活力指数、主根长及幼苗鲜质量分别减少17.65%、48.66%、62.08%和37.48%，说明ZL 抑制了黄瓜种子萌发和幼苗生长；而ZN 处理下，种子的各个测定指标量与ZL 处理相比均提高，种子的活力指数、幼苗鲜质量、主根长增幅分别为35.69%、18.25%和49.14%，说明喷施NO 能减轻提取物对黄瓜种子和幼苗的胁迫伤害。

2.2 NO 对紫茎泽兰提取物胁迫下黄瓜幼苗根尖组织结构的影响

由图3-A 和图3-D 可知，对照和NO 处理的黄瓜幼苗根尖在100 倍电镜下观察，根尖细胞平滑整齐，根尖没有被伤害。ZL 处理对黄瓜幼苗根尖结构破坏非常大，表层细胞凋落，排列无规律，细胞形状改变（图3-G）；添加NO 处理（ZN）后，与对照和NO 处理比较，黄瓜根尖细胞的组织结构基本相当（图3-J）。表明NO 能有效缓解紫茎泽兰提取物对黄瓜根尖组织结构的胁迫。

2.3 NO 对紫茎泽兰提取物胁迫下黄瓜幼苗根系抗氧化系统的影响

由图4 可知，在幼苗生长过程中，ZL 处理下幼苗根系SOD、POD、CAT和APX 活性高于CK。与CK相比，ZL 处理的幼苗SOD 活性在4、6、8、10、12 d时分别比对照提高20.38%、139.85%、36.22%、36.98%和12.77%，达到显著性差异（P＜0.05）；ZL 处理的幼苗POD 活性在4、6、8、10、12 d 时分别比CK 提高89.23%、135.25%、59.61%、69.87%和160.75%。ZL 处理的幼苗CAT 活性在4、6、8、10、12 d 时分别比CK 提高139.50%、69.85%、43.57%、56.36%和36.62%，达到显著性差异（P＜0.05）；ZL 处理的幼苗APX 活性在4、6、8、10、12 d 时分别比CK 提高22.96%、36.55%、20.99%、12.31%和9.00%，达到显著性差异（P＜0.05）。与ZL 处理相比，ZN 处理的SOD、POD、CAT 和APX 活性普遍高于ZL 处理。其中，ZN 处理下SOD 活性在8、12 d 时分别比ZL 处理高23.58%和52.74%，达到显著差异（P＜0.05）；POD 活性在6、8、10、12 d 时比ZL 处理分别高22.74%、19.63%、13.31%和7.13%，差异达显著性水平（P＜0.05）；CAT 活性在8、10 d 时分别比ZL 处理提高22.62%和20.46%，差异达显著水平（P＜0.05）；APX 活性在4、6、8、10、12 d 时比ZL 处理分别高9.73%、6.62%、4.20%、9.63%和4.63%，10 d 时达到显著差异（P＜0.05）。

从图5 可以看出，ZL、ZN 处理下MDA、超氧阴离子（）、抗坏血酸AsA 和可溶性蛋白含量均高于CK。与CK 相比，ZL 处理的MDA 含量在4、6、8、10、12 d 时分别增加49.21%、44.23%、11.24%、20.93%和25.50%；ZL 处理的含量在4、6 d 时较CK 分别增加29.28%和26.02%；ZL 处理的AsA 含量在4、6、8、10、12 d 时较CK 分别增加139.91%、44.81%、87.92%、41.48%和47.53%；ZL 处理的可溶性蛋白含量在4、6、8、10、12 d 时较CK 分别增加71.22%、59.61%、29.71%、46.06%和54.69%，均达到显著差异（P＜0.05）。且不同时间段ZN 处理的MDA 和超氧阴离子含量低于ZL 处理，而ZN 处理的AsA 和可溶性蛋白含量高于ZL 处理。与ZL 处理相比，ZN 处理的MDA 含量在4、6、8、10、12 d 时分别降低4.18%、6.41%、3.60%、7.79%和11.48%，12 d 时达到显著性差异（P＜0.05）；ZN 处理的含量在4、6、8、10、12 d 时分别降低3.33%、1.32%、2.31%、6.50%和0.78%，但差异不显著；ZN 处理的AsA 含量在4、6、8、10、12 d 时分别增加4.15%、10.43%、14.23%、5.63%和7.08%，8 d 时差异显著（P＜0.05）；ZN 处理的可溶性蛋白含量在4、6、8、10、12 d 时分别上升了9.23%、5.79%、21.37%、8.26%和3.80%。

由图4、5 分析可知，紫茎泽兰提取物对黄瓜种子萌发有一定的伤害，MDA 和超氧阴离子（）含量升高，幼苗内产生的活性氧增多从而使植物细胞的膜脂过氧化程度加剧，同时也诱导SOD、POD、CAT、APX 抗氧化酶活性、可溶性蛋白和抗氧化剂AsA 含量升高，外源NO 不同程度提高了紫茎泽兰提取物胁迫下黄瓜幼苗根系抗氧化酶活性和抗氧化剂AsA 含量，从而降低膜脂过氧化程度，增强了幼苗抗紫茎泽兰提取物胁迫的能力。

3 讨论

3.1 外源NO 缓解紫茎泽兰提取物对黄瓜种子萌发和幼苗生长伤害的效应

化感物质是一种胁迫信号，通常作用于受体植物的细胞表面，细胞内部结构被破坏，影响受体植物的生长发育[19]，徐成东等[20]、曹子林等[21]的研究证实了这一点。试验结果显示，1 g/L 紫茎泽兰提取物水溶液胁迫下，黄瓜种子萌发生长的多项指标均显著低于对照。由此推测，紫茎泽兰提取物产生的化感物质可能抑制黄瓜种子萌发和幼苗的生长，还有待进一步的深入研究。添加外源NO 处理（ZN），黄瓜种子萌发生长的多项指标均明显好于ZL 处理。说明，外源NO 参与紫茎泽兰提取物对黄瓜种子萌发和幼苗生长胁迫的调节，增强了黄瓜对紫茎泽兰提取物胁迫的适应性，可有效地缓解提取物对黄瓜种子萌发和幼苗生长的破坏。

3.2 外源NO 缓解紫茎泽兰提取物对黄瓜幼苗根尖组织结构损伤的效应

化感胁迫诱导植物细胞损伤，细胞外部形状发生变化。曾有研究报道，蚕豆被三叶鬼针草（Bidens pilosa L.）水浸提液处理，其根尖横切面和纵切面细胞明显变小，细胞紧凑整齐排列，径向细胞层数增加[22]。紫茎泽兰内部主要的化感物质会导致根尖组织结构受到伤害，细胞变小，细胞质变薄[23]。本试验结果表明，紫茎泽兰提取物胁迫使幼苗根尖表层细胞脱离下来，细胞排列顺序杂乱，因此，紫茎泽兰提取物对黄瓜幼苗根尖组织结构造成严重的损伤，而添加NO 处理（ZN），根尖表面无凹凸，细胞排列整齐、紧凑、饱满，无干瘪萎焉现象，与对照和NO 处理（NO）相比差异不显著。说明，外源NO 可显著缓解紫茎泽兰提取物对黄瓜幼苗根尖组织结构的损伤，保证根尖细胞良好的生长发育。

3.3 外源NO 缓解紫茎泽兰提取物对黄瓜幼苗根系抗氧化系统的效应

化感胁迫往往伴随氧化胁迫的发生，当受体细胞受到化感胁迫时，细胞内抗氧化酶活性迅速升高，及时清除ROS，使ROS 含量被控制在较低水平[24]。随着化感胁迫时间的延长，植物应激反应下降，酶活性降低，不足以消除ROS，加剧了膜脂过氧化程度。本试验结果表明，不同时间段紫茎泽兰提取物胁迫处理（ZL），黄瓜幼苗根系SOD、POD、CAT 和APX 活性、MDA 和超氧阴离子（）含量均高于CK，且随着胁迫时间的延长，抗氧化酶活性呈先升高后下降，抗坏血酸AsA 和可溶性蛋白含量迅速下降，MDA 含量在胁迫后期（10～12 d）迅速升高。说明，紫茎泽兰提取物对黄瓜幼苗根系产生了氧化胁迫伤害。

吴雪霞[25]研究表明，外源NO 能够增强NaCl 胁迫下番茄和黄瓜幼苗叶片SOD、POD、CAT 和APX活性。本试验结果表明，添加外源NO 处理（ZN），紫茎泽兰提取物胁迫下黄瓜幼苗根系SOD、POD、CAT 和APX 活性明显提高，与吴雪霞[25]的研究结果相似。说明，外源NO 参与了CAT 和APX 等抗氧化酶的代谢调节，外源NO 通过诱导抗氧化酶活性升高，从而提高了黄瓜幼苗根系抗氧化能力。

抗坏血酸AsA 是植物体内重要的抗氧化物质，在APX 存在下，AsA 可清除活性氧[26]。本试验中，随紫茎泽兰提取物胁迫时间延长，AsA 含量下降，APX 活性先升高后下降，超氧阴离子（O2-）含量升高，表明细胞内ROS 含量积累，激发黄瓜自身应激以抵抗逆境，导致清除H2O2的APX 活性迅速增加，6 d 时达到峰值。在幼苗生长后期（8～12 d），黄瓜幼苗为抵抗胁迫伤害消耗大量的AsA，使其含量迅速下降，由于AsA 含量的减少使APX 活性也急速下降，从而导致H2O2不能被分解，膜脂过氧化加剧，MDA 含量增加，幼苗受到胁迫伤害[27]。在本试验中，ZN 处理的不同时间段，黄瓜幼苗根系中AsA 含量、APX 活性普遍比ZL 处理高，有可能是因为NO参与黄瓜自身应激反应的调控，使AsA 含量、APX活性保持在较高的水平，减轻提取物对黄瓜幼苗的伤害，还有待进一步研究。